Melatonin enhances the effect of ABT-737 in acute monocytic leukemia THP-1 cells

封面

如何引用文章

全文:

详细

Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine, MEL) is a hormone synthesized by the pineal gland. Due to its oncostatic effect, it can be considered as an antitumor agent and used for combination therapy. ABT-737, a Bcl-2 inhibitor, promotes cell death after treatment with agents that induce pro-apoptotic signals. In the present study, the combined effect of MEL and ABT-737 on changes in proliferative and mitotic activity, mitochondrial membrane potential, intracellular production of reactive oxygen species (ROS) and cytosolic Ca2+ was studied. Moreover, changes in the expression of anti- and pro-apoptotic proteins (Bcl-2 and Bax), autophagy markers (LC3A/B (I, II)), endoplasmic reticulum stress markers (chaperones BIP and PDI, CHOP) were studied under these conditions. The effect of MEL together with ABT-737 led to an increase in the level of cytosolic Ca2+, intracellular production of ROS, and a decrease in the membrane potential of mitochondria. Under these conditions, the content of Bcl-2 increased, while the level of Bax decreased. The activation of CHOP stimulated autophagy and led to a decrease in the expression of BIP and PDI chaperones. These results suggest that MEL is able to enhance the effects of other chemotherapeutic agents and can be used in strategies in the treatment of cancer.

全文:

Введение

В настоящее время онкологические заболевания признаны глобальной проблемой современной медицины, которая не имеет полноценного решения. Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) ‒ гетерогенное злокачественное клональное заболевание кроветворной системы, характеризующееся неконтролируемой пролиферацией незрелых, аномальных бластных клеток и нарушением продукции нормальных клеток крови [1]. Основой консервативного лечения данного заболевания является применение химиотерапевтических ДНК-тропных препаратов (цитарабина (ЦИТ), доксорубицина и т.д.) [2]. В случае острого промиелоцитарного лейкоза (вариант ОМЛ с преобладанием аномальных промиелоцитов) в качестве дифференцирующей терапии используется транс-ретиноевая кислота (ATRA) [3]. Применяют также таргетную терапию, направленную на различные компоненты внутриклеточных механизмов выживания опухолевых клеток. Один из препаратов таргетной терапии – АВТ-737 [4] – ингибитор BclXL, Bcl-2 и Bclw, связывающийся с гидрофобной бороздкой и предотвращающий секвестрацию проапоптотических белков, таких как BAD и Bim [5].

Эффективность терапии ОМЛ снижается с увеличением возраста пациента. Это связано в первую очередь с побочным (неспецифическим) действием традиционных химиотерапевтических препаратов, в равной степени индуцирующих гибель как лейкозных бластов, так и здоровых клеток, прежде всего гемопоэтических клеток костного мозга [6]. Чтобы устранить побочное действие химиопрепаратов и повысить эффективность терапии ОМЛ необходимо уменьшить дозы противоопухолевых агентов, применяемых в клинике, и добавить эффективные препараты, не обладающие собственной токсичностью, но повышающие эффективность низких доз основных противоопухолевых препаратов.

Одним из перспективных препаратов, применяемых в терапии ОМЛ, является гормон шишковидной железы мелатонин (МЕЛ) – N-ацетил-5-метокситриптамин, производное биогенного амина серотонина. Амфифильные свойства МЕЛ позволяют ему легко проникать через клеточную мембрану и достигать любой клеточной структуры [7]. Исследования последних лет показали, что МЕЛ обладает онкостатической активностью в отношении опухолей разного типа. Противоопухолевую активность МЕЛ наблюдали при раке кожи [8], желудочно-кишечного тракта [9], молочной железы [10], а также при глиоме [11] и лейкозе [12]. Причем в некоторых типах опухолевых клеток МЕЛ может не только подавлять пролиферацию, но и модулировать проапоптотические сигнальные пути [13]. МЕЛ действует синергично с другими химиотерапевтическими агентами, усиливая их воздействие на лейкозные клетки. Кроме того, он способен супрессировать опухолевые клетки, не проявляя при этом токсического действия [14]. Показано, что использование МЕЛ в нетоксической концентрации совместно с низкими дозами противоопухолевых препаратов может усиливать токсическое действие этих препаратов в отношении клеток рака легкого [15], меланомы [16], плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC) [17] и толстой кишки [18], что приводит к снижению их токсического действия на здоровые клетки.

Ранее мы изучали действие как одного МЕЛ, так и в комбинации со сниженными нетоксичными концентрациями противоопухолевых препаратов разных фармакологических групп, таких как ATRA, ЦИТ и ABT-737, на клетки MV4-11 (модель ОМЛ) и клетки HL-60 (модель ОПЛ) [19–23]. Нами показано, что в концентрации 1 мМ МЕЛ повышал цитотоксическое действие таких препаратов, как ATRA, ЦИТ, АВТ-737, что приводило к снижению количества жизнеспособных клеток, а также к снижению их пролиферативной и митотической активности. Стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР) считается основным процессом при различных патологических состояниях, т.е. его усиление подразумевает наличие той или иной патологии [24]. Мы наблюдали, что МЕЛ совместно с противоопухолевыми препаратами снижал содержание таких маркеров ЭПР-стресса, как иммуноглобулинсвязывающий белок BIP и протеиндисульфидизомераза (PDI). Это ослабляло защиту клеток ОМЛ от стресс-индуцированного апоптоза и приводило к активации такого проапоптотического фактора, как белок CHOP, гомологичный C/EBP. Известно, что ЭПР-стресс может запускать аутофагию, которая представляет собой многоэтапный процесс самодеградации клеточных компонентов, в котором белки и органеллы изолируются и модифицируются внутри аутофагосом – цитоплазматических двуслойных мембранных везикул, а затем переносятся в лизосомы [25, 26]. Показано, что окислительный стресс является инициатором и основным фактором как ЭПР-стресса, так и аутофагии [27], хотя основные механизмы, ответственные за эти события, до сих пор неизвестны.

Нами изучено влияние МЕЛ и ABT-737 на изменение пролиферативной активности, мембранного потенциала (ΔΨm), цитозольного Ca2+, продукцию АФК, а также изменения экспрессии маркеров ЭПР-стресса (BIP, PDI, CHOP) и аутофагии в клетках острого моноцитарного лейкоза (ОМоЛ) THP-1. ОМоЛ считается одной из разновидностей ОМЛ, при которой бластные клетки в костном мозге и крови в основном представлены предшественниками моноцитов. Клеточная линия THP-1, выделенная из периферической крови годовалого мальчика с ОМоЛ [28], является моделью ОМоЛ и широко используется при проведении исследований, при этом клетки этой линии находятся не только в моноцитарном, но и в макрофагоподобном состоянии [29, 30].

Экспериментальная часть

Клеточные культуры и условия культивирования. Линия клеток THP-1 (TIB-202), происходящая из клеток ОМоЛ человека, получена из коллекции клеточных культур ATCC (США). Клетки THP-1 культивировали в среде RPMI 1640/F12 (“Sigma-Aldrich”, США), содержащей 100 мкг/мл сульфата канамицина (“ПанЭко”, Россия) и 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“Gibco”, США) в CO2-инкубаторе (37°C, влажность 95% и 5% CO2).

Оценка цитотоксического действия исследуемых препаратов на клетки ОМоЛ. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием метода извлечения резазурина. Клетки (плотность 5 × 103 клеток/лунку) высевали в 96-луночный планшет. Через 24 ч клетки обрабатывали МЕЛ (“Sigma-Aldrich”, США) в концентрации 1–10 000 мкМ и ABT-737 (“Thermo Fisher Scientific”, США) (от 0.001 до 10 мкМ). Через 24 ч после добавления исследуемых веществ в каждую лунку вносили резазурин (“Sigma-Aldrich”) в конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировали в течение 4 ч в СО2-инкубаторе. Флуоресцентный анализ проводили на устройстве для считывания микропланшетов Infinite F200 (“Tecan”, Швейцария) при длине волны возбуждения 535 нм и длине волны испускания 595 нм. Данные представлены в процентах от контроля (необработанные клетки).

Выделение моноцитов из периферической крови человека. Моноциты получены из мононуклеарной фракции периферической крови здоровых доноров с использованием набора MojoSort Human Pan Monocyte Isolation Kit (“Biolegend”, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Моноциты культивировали в среде RPMI/F12 с добавлением 10% FBS, 40 мкг/мл гентамицина в 96-луночном планшете в концентрации 5 ×103 кл/лунку в течение 24 ч в СО2-инкубаторе (37°С, 5% СО2, влажность 95%).

Анализ митотической активности клеток ТНР-1. Для определения митотической активности клетки сначала инкубировали с исследуемыми веществами в течение 24 ч, а затем центрифугировали (4 мин, 250 g), промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем клетки окрашивали бисбензимидом H33342 (“Sigma-Aldrich”). Митотические клетки подсчитывали, используя флуоресцентный микроскоп DM6000 (“Leica”, ФРГ). Митотический индекс рассчитывали по формуле МИ = (P + M + A + T)/N, где P + M + A + T – сумма всех клеток в фазе профазы, метафазы, анафазы и телофазы соответственно, а N – общее количество клеток.

Влияние исследуемых препаратов на жизнеспособность клеток ОМоЛ. Пролиферативную активность и гибель клеток определяли с использованием красителя трипанового синего (“Sigma-Aldrich”). Культивируемые клетки центрифугировали в течение 4 мин при 250 g, а затем промывали раствором PBS. Для оценки количества и жизнеспособности клеток использовали 0.4%-ный раствор трипанового синего. Опыты проводили не менее чем в 10 повторах.

Измерение внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК). Продукцию АФК анализировали с использованием флуоресцентного красителя 2’,7’-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетата (DCFH-DA, Ex-485 нм/Em-530 нм, “Sigma-Aldrich”). Для анализа продукции АФК к клеткам (1 × 106 клеток/мл) добавляли 10 мкМ DCFH-DA, после чего инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 10 мин. После этого клетки однократно промывали в PBS. В качестве положительного контроля использовали H2O2 (1 мкМ). Изменение окислительной активности определяли на проточном цитометре BD Accuri C6 (“Biosciences”).

Измерение мембранного потенциала митохондрий в клетках ТНР-1. Митохондриальный потенциал определяли с использованием флуоресцентного красителя 3,3’-дигексилоксакарбоцианинйодида DiOC6(3) (“Sigma-Aldrich”) (Ex-482 нм/Em-501 нм). К суспензии клеток (106 клеток/мл) добавляли 10 нМ DiOC6(3) и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 30 мин. Клетки однократно промывали в PBS. В качестве положительного контроля использовали 0.5%-ный сапонин. Изменение мембранного потенциала оценивали с использованием проточного цитометра BD Accuri C6 (“Biosciences”).

Измерение содержания цитозольного Са2+ в клетках ТНР-1. Изменение содержания цитозольного Ca2+ определяли с помощью флуоресцентного красителя Fluo-4 AM (“Sigma-Aldrich”) (Ex-494 нм/Em-516 нм). Для оценки изменения содержания цитозольного Ca2+ клетки (106 клеток/мл) отмывали в PBS. К клеточной суспензии добавляли Fluo-4 AM (2 мкМ) и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 30 мин. После окрашивания клетки дважды промывали PBS. Содержание Ca2+ в цитозоле измеряли с помощью проточного цитометра BD Accuri C6 (“Biosciences”).

Электрофорез и иммуноблот-анализ. К клеткам THP-1 добавляли выбранные количества МЕЛ (1000 мкМ) и ABT-737 (2 и 7 мкМ). Через 24 ч клетки дважды промывали ледяным PBS. Клетки центрифугировали при 1500 g в течение 3 мин при комнатной температуре. Полученный осадок солюбилизировали в лизирующем буфере с добавлением ингибиторов протеиназы/фосфатазы. После встряхивания на шейкере при 4°C в течение 2 ч образцы центрифугировали при 13 000 g в течение 10 мин. Концентрацию белка в супернатантах измеряли по методу Брэдфорда. Полученные образцы растворяли в буфере для образцов Лэммли (“Bio-Rad”, США), нагревали до 95°C в течение 3 мин. Белки лизата разделяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях (SDS) в 12.5%-ном полиакриламидном геле. Затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0.2 мкм) с помощью Вестерн-блотинга (“Bio-Rad”). Мембрану блокировали в растворе Roti-block (“Carl Roth GmbH & Co.”, Германия) при комнатной температуре в течение 1 ч, промывали водой и инкубировали с первичными антителами, как описано в инструкции. Моноклональные антитела к белку, гомологичному C/EBP (CHOP), к LC3A/B-I/II и поликлональные антитела к PDI, белку BIP, получены от “Cell Signaling” (CША). Моноклональные антитела к Bcl-2 получены из “Santa Cruz Biotehnology” (США), моноклональные антитела к BAX были фирмы “Abcam” (Великобритания). Для нормирования использовали антитела к анти-глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназе (GAPDH, “Cell Signaling”). Белковые полосы визуализировали с использованием системы обнаружения ECL (ChemiDoc Touch Imaging System, “Bio-Rad”).

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием однофакторного метода ANOVA и апостериорного анализа Стьюдента–Ньюмана–Кеулса. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

Результаты исследования

Сначала мы проверили цитотоксический эффект МЕЛ (рис. 1a) и химиотерапевтического препарата ABT-737 на клетках THP-1, служащих моделью клеток ОМоЛ. Чтобы выявить цитотоксическое действие препаратов, клетки культивировали в течение 24 ч с МЕЛ в концентрации от 1 до 10 000 мкМ и ABT-737 – от 0.001 до 10 мкМ (рис. 1). Из рис. 1а видно, что в низких концентрациях МЕЛ (до 100 мкМ) не оказывал влияния на жизнеспособность клеток THP-1. Однако в случае 1 мМ МЕЛ жизнеспособность клеток уменьшалась на 15% относительно контроля, а с увеличением концентрации до 10 мМ снижалась почти на 100%. Аналогичным образом мы подобрали нетоксичную концентрацию ABT-737 (рис. 1б). Из рис. 1 видно, что ABT-737 в концентрации до 5 мкМ не влиял на жизнеспособность клеток THP-1, при увеличении концентрации до 10 мкМ жизнеспособность клеток снижалась на 20%.

 

Рис. 1. Концентрационная зависимость цитотоксических эффектов МЕЛ (а) и ABT-737 (б) в клетках ТНР-1. Долю жизнеспособных клеток определяли через 24 ч после добавления веществ по интенсивности восстановления резазурина. Клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью 5 × 103 клеток на лунку и обрабатывали веществами в разных концентрациях. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6).

 

Для оценки жизнеспособности клеток мы выбрали концентрации ABT-737 (2 и 7 мкМ) и МЕЛ (1 мМ). Поскольку токсичность химиотерапевтических препаратов остается проблемой при лечении рака, мы использовали низкую концентрацию ABT-737 в сочетании с нетоксичной концентрацией МЕЛ.

Далее мы оценили влияние ABT-737 и МЕЛ на пролиферативную активность и гибель клеток (рис. 2а). Мы наблюдали, что ABT-737 (7 мкМ) снижал на 20% число жизнеспособных клеток по сравнению с контролем (столбец 2 vs. 1). В присутствии ABT-737 (7 мкМ) количество погибших клеток увеличивалось в 10 раз по сравнению с контролем (столбцы 2 vs. 1). Действие ABT-737 (2 мкМ) на жизнеспособные клетки и число погибших клеток оставались в пределах контрольных значений (столбец 3 vs. 1). Добавление МЕЛ (1 мМ) приводило к снижению числа жизнеспособных клеток на 35% относительно контроля, при этом количество погибших клеток не изменялось (столбец 4 vs. 1). Совместное действие МЕЛ и ABT-737 в сниженной концентрации уменьшало количество жизнеспособных клеток примерно в 2 раза по сравнению с контролем и на 50% по сравнению с ABT-737. Количество погибших клеток ТНР-1 при комбинированном действии МЕЛ с ABT-737 увеличилось в 12 раз относительно контроля (столбец 5 vs. 1) и в 10 раз по сравнению только с ABT-737 (столбец 5 vs. 3).

 

Рис. 2. Жизнеспособность и митотическая активность клеток ТНР-1 после 24 ч инкубации с МЕЛ и АВТ-737. а – Изменение пролиферации. б – Изменение митотического индекса в присутствии МЕЛ и ЦИТ. Количество жизнеспособных клеток интактной культуры (контроль, без обработки препаратами) принимали равным 100%. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6). *р < 0.05 – значимое изменение по сравнению с контролем, #p < 0.05 – значимое изменение по сравнению с АВТ-737.

 

Известно, что МЕЛ способен снижать пролиферацию опухолевых клеток, например клеток рака молочной железы человека MCF-7 и гипофиза GH3 [31, 32], поэтому снижение числа жизнеспособных клеток в присутствии МЕЛ и при совместном применении МЕЛ и АВТ-737 в низкой концентрации может быть связано со снижением их митотической активности. На следующем этапе мы оценили влияние ABT-737 и МЕЛ на изменение митотического индекса (МИ) клеток THP-1 (рис. 2б). ABT-737 (7 мкМ) уменьшал МИ клеток THP-1 на 50% (столбец 2 vs. 1). ABT-737 в сниженной концентрации не влиял на МИ (столбец 3 vs. 1), тогда как MEЛ снижал МИ на 30% по сравнению с контролем (столбец 4 vs. 1). При совместном действии ABT-737 и МЕЛ МИ уменьшался в 2 раза по сравнению с контролем (столбец 5 vs. 1) и на 60% по сравнению с одним ABT-737 (2 мкМ) (столбец 5 vs. 3). Полученные результаты позволяют предположить, что MEЛ способен усиливать цитотоксическое действие ABT-737.

Известно, что MEЛ не проявляет токсичности в здоровых клетках человека и способен повышать жизнеспособность нейтрофилов и лимфоцитов в присутствии 500 мкМ Н2О2 [33], поэтому мы исследовали влияние только MEЛ и МЕЛ в комбинации с ABT-737 на жизнеспособность здоровых клеток человека – моноцитов (рис. 3). Из рис. 3 видно, что ни MEЛ, ни комбинация МЕЛ с АВТ-737 в низкой концентрации, добавляемые к моноцитам, не приводили к изменению жизнеспособности клеток, что говорит об отсутствии цитотоксического действия как MEЛ, так и МЕЛ в комбинации с АВТ-737 на здоровые клетки.

 

Рис. 3. Влияние МЕЛ на жизнеспособность моноцитов человека. Клетки инкубировали с МЕЛ в течение 24 ч. Количество живых клеток в интактной культуре (контроль, без обработки препаратами) принимали за 100%. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6).

 

Известно, что повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий приводит к индукции апоптоза, и существенную роль в этом играют белки семейства Bcl-2, которые, связываясь с Bах/Bak, поддерживают целостность митохондриальной мембраны и предотвращают апоптоз [34]. В опухолевых клетках нарушена регуляция белков семейства Bcl-2, повышенное содержание этих белков приводит к тому, что клетки становятся устойчивыми к апоптозу [34]. Более того, ABT-737 способствует гибели клеток после обработки агентами, индуцирующими проапоптотические сигналы [5]. В настоящем исследовании мы проверили содержание Bcl-2 и Bax в условиях нашего эксперимента (рис. 4). На рис. 4а приведены Вестерн-блоты, окрашенные антителами к Bcl-2 и Bax. GAPDH использовали для контроля белковой нагрузки. На рис. 4б, в показаны количественные изменения в содержании белков, представленные как соотношение оптической плотности белков и GAPDH. Под действием АВТ-737 (7 мкМ) содержание Bcl-2 увеличивалось на 38%, а Bax снижалось на 60% по сравнению с контролем (столбец 2 vs. 1), тогда как АВТ-737 в концентрации 2 мкМ снижал уровень Bcl-2 и Bax на 55 и 65% соответственно (столбец 3 vs. 1). МЕЛ снижал уровень Bcl-2 на 84% и повышал уровень Bax в 3.5 раза (столбец 4 vs. 1). Совместное воздействие МЕЛ и АВТ-737 (2 мкМ) приводило к снижению содержания Bcl-2 на 95% и к повышению содержания Bax в 3.5 раза (столбец 5 vs. 1). Комбинация МЕЛ и АВТ-737 (2 мкМ) снижала содержание Bcl-2 на 55% (по сравнению с действием одного МЕЛ), но содержание Bax не изменялось (столбец 5 vs. 4).

 

Рис. 4. Влияние МЕЛ и его комбинации с АВТ-737 на содержание белков Bcl-2 и Bax в клетках ТНР-1. Клетки инкубировали с препаратами в течение 24 ч. а – Иммуноокрашивание антителами к Bcl-2 и Bax. GAPDH использовали в качестве контроля белковой нагрузки. б – Диаграмма соотношения Bcl-2/GAPDH. в – Диаграмма соотношения Bax/GAPDH. В качестве контроля использовали уровень белка в клеточном лизате без добавок (100%). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 4). *p < 0.05 – Значимое изменение по сравнению с контролем, #р < 0.05 – значимое изменение по сравнению с АВТ-737.

 

Изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрий может приводить к формированию поры неспецифической проницаемости (мРТР) cо снижением мембранного потенциала, увеличением продукции АФК и выходу Ca2+ в цитозоль [35]. По этой причине мы изучили влияние МЕЛ и ABT-737 на изменение содержания цитозольного Ca2+ (рис. 5), а поскольку в освобождении Ca2+ участвует белок CHOP, гомологичный C/EBP, мы оценили также изменение содержания CHOP в клетках. При добавлении ABT-737 (7 мкМ) к клеткам THP-1 содержание цитозольного Са2+ (рис. 5а) в них увеличивалось на 20% (столбец 2 vs. 1). Мы не заметили каких-либо изменений в клетках THP-1 в присутствии ABT-737 (2 мкМ) (столбец 3 vs. 1), обработка клеток МЕЛ также не привела к значимому эффекту (столбец 4 vs. 1). Однако при совместном добавлении ABT-737 (2 мкМ) и МЕЛ содержание цитозольного Са2+ в клетках повышалось на 12% по сравнению с контролем (столбец 5 vs. 1) и на 15% относительно одного МЕЛ (столбец 5 vs. 4). В присутствии ABT-737 (7 и 2 мкМ) содержание СНОР в клетках THP-1 снижалось на 40% (столбцы 2 и 3 vs. 1), тогда как МЕЛ повышал уровень CHOP на 45% относительно контроля (столбец 4 vs. 1). Совместное действие ABT-737 (2 мкМ) с МЕЛ приводило к увеличению содержания CHOP на 50% относительно контроля (столбец 5 vs. 1) и в 2 раза по сравнению с одним только ABT-737 (столбец 5 vs. 3).

 

Рис. 5. Влияние МЕЛ и АВТ-737 на изменение цитозольного Са2+ и содержания CHOP в клетках ТНР-1. Клетки инкубировали с препаратами в течение 24 ч. а – Изменение содержания цитозольного Са2+. Интенсивность флуоресценции интактных клеток использовали в качестве контроля, данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5). б – Иммуноокрашивание антителами к CHOP, GAPDH использовали в качестве контроля белковой нагрузки. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 4). *p < 0.05 – значимое изменение по сравнению с соответствующим контролем, #р < 0.05 – значимое изменение по сравнению с АВТ-737.

 

Ранее на клетках HL-60, служащих моделью ОПЛ, мы показали, что МЕЛ в комбинации с ABT-737 в сниженной концентрации вызывает деполяризацию митохондриальной мембраны, увеличивая падение мембранного потенциала, что приводит к повышению продукции АФК с последующим усилением аутофагии [21]. В настоящей работе нами изучено изменение ΔΨm, продукции АФК и содержания таких маркеров аутофагии, как LC3A/B – I (16 кДа) и LC3A/B – II (14 кДа) в присутствии АВТ-737 и МЕЛ в клетках ТНР-1, служащих моделью ОМоЛ (рис. 6). В качестве положительного контроля использовали 0.5%-ный сапонин. Из рис. 6 видно, что АВТ-737 (7 и 2 мкМ) не изменял ΔΨm по сравнению с контролем (столбцы 3 и 4 vs. 1). Добавление МЕЛ к клеткам приводило к снижению ΔΨm на 45% (столбец 5 vs. 1). Совместное действие МЕЛ и АВТ-737 приводило к снижению ΔΨm на 47% относительно контроля (столбец 6 vs. 1) и на столько же относительно ABT-737 (столбец 6 vs. 4). На рис. 6б показано изменение продукции АФК в наших условиях. Н2О2 (1 мкМ) использовали в качестве положительного контроля. АВТ-737 (7 и 2 мкМ) не влиял на уровень АФК по сравнению с контролем (столбцы 3 и 4 vs. 1). Добавление МЕЛ приводило к повышению продукции АФК в 7 раз (столбец 5 vs. 1), тогда как при совместном применении МЕЛ и АВТ-737 (2 мкМ) продукция АФК возрастала в 9 раз по сравнению с контролем (столбец 6 vs. 1) и в 6 раз по сравнению с АВТ-737 (столбец 6 vs. 4).

 

Рис. 6. Влияние МЕЛ и АВТ-737 на изменение ΔΨм, внутриклеточной продукции АФК и маркеров аутофагии (LC3A/B-I/II) в клетках ТНР-1. Клетки инкубировали с препаратами в течение 24 ч. а – Изменение ΔΨм в клетках ТНР-1. б – Изменение внутриклеточной продукции АФК; данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 6). в – Иммуноокрашивание антителами к LC3A/B-I/II, GAPDH использовали в качестве контроля белковой нагрузки. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 4). *p < 0.05 – значимое изменение по сравнению с соответствующим контролем, #р < 0.05 – значимое изменение по сравнению с АВТ-737.

 

Аутофагия представляет собой многоэтапный процесс самодеградации клеточных компонентов, при котором белки и органеллы секвестрируются и модифицируются внутри аутофагосом, а затем переносятся в лизосомы [25]. МЕЛ может регулировать аутофагию, модулируя ее активность, улучшая пути протеолиза либо предотвращая митохондриальную дисфункцию из-за снижения окислительного стресса, либо повышая эффективность ЭПР, что приводит к снижению количества неправильно свернутых белков [36]. Нами изучено изменение уровней LC3A/B (I, II) в клетках THP-1. GAPDH использовали в качестве контроля белковой нагрузки. На рис. 6в (в верхней части) показан Вестерн-блот, окрашенный антителами LC3A/B (I, II). В нижней части рис. 6в представлены данные количественного изменения в содержании белков и соотношение белков к GAPDH. В присутствии АВТ-737 (7 и 2 мкМ) содержание LC3A/B-I в клетках THP-1 в обоих случаях снижалось на 70%, в то время как экспрессия LC3A/B-II возрастала на 10 и 20% соответственно (столбцы 2 и 3 vs. 1). MЕЛ повышал уровень LC3A/B-I и LC3A/B-II на 70 и 50% соответственно, по сравнению с контролем (столбец 4 vs. 1). Совместное воздействие АВТ-737 (2 мкМ) и MEЛ приводило к увеличению содержания LC3A/B-I и LC3A/B-II в 2 раза и на 85% соответственно, относительно контроля (столбец 5 vs. 1). Обработка MEЛ и ABT-737 увеличивала содержание LC3A/B-I в 5 раз, а LC3A/B-II на 40% по сравнению с одним только ABT-737 (столбец 5 vs. 3).

Поскольку ЭПР участвует в таких клеточных функциях, как кальциевый гомеостаз, синтез белков или фосфолипидов, а ЭПР-стресс способен инициировать аутофагию [37, 38], мы проверили изменение содержания белков BIP и PDI в наших экспериментальных условиях (рис. 7). В верхней части рис. 7 приведены Вестерн-блоты, окрашенные антителами, в нижней части – количественное изменение содержания белков, измеренное по соотношению оптической плотности белков и GAPDH. Из рис. 7 видно, что уровни BIP и PDI не изменялись при добавлении ABT-737 (7 мкМ) (столбец 2 vs. 1), в то время как ABT-737 в концентрации 2 мкМ увеличивал содержание BIP в 2 раза, а PDI на 25% (столбец 3 vs. 1). МЕЛ снижал содержание BIP и PDI на 35 и 50% соответственно (столбец 4 vs. 1). Совместное действие МЕЛ с АВТ-737 (2 мкМ) приводило к снижению уровней BIP и PDI на 20 и 50% относительно контроля (столбец 5 vs. 1) и на 70% для BIP и 60% для PDI по сравнению с ABT-737 (столбец 5 vs. 3).

 

Рис. 7. Влияние МЕЛ и его комбинации с АВТ-737 на содержание BIP и PDI в клетках ТНР-1. Клетки инкубировали с препаратами в течение 24 ч. а – Иммуноокрашивание антителами к BIP и PDI, GAPDH использовали в качестве контроля белковой нагрузки. б – Диаграмма, отражающая соотношение BIP к GAPDH. в – Диаграмма, отражающая соотношение PDI к GAPDH. Уровень белка в клеточном лизате без каких-либо добавок служил контролем (100%). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 4). *p < 0.05 – значимое изменение по сравнению с контролем, #р < 0.05 – значимое изменение по сравнению с АВТ-737.

 

Обсуждение результатов

Взаимосвязь между МЕЛ и онкологическими заболеваниями изучают в течение последних 80 лет. Противоопухолевая активность этого гормона подтверждается результатами многочисленных исследований. Так, показаны антипролиферативные, антимиграционные и проапоптотические эффекты МЕЛ в сочетании с 5-фторурацилом в клетках рака толстой кишки (линии SW620 и LOVO) [18]. МЕЛ ингибировал также пролиферацию опухолевых стволовых клеток, выделенных из клеток CSC рака яичников [39], подавлял рост клеток MDA-MB-231 рака молочной железы как in vitro, так и in vivo [40], а также пролиферацию клеток MG-63 остеосаркомы человека [41]. Согласно полученным нами результатам, МЕЛ подавлял пролиферативную и митотическую активность клеток ТНР-1 ОМоЛ. Следует отметить, что эффект подавления усиливался при применении комбинации МЕЛ и ABT-737 в сниженной концентрации.

Противоопухолевое действие МЕЛ, как показано в ряде работ, имеет дозозависимый эффект. Для лечения различных типов рака необходимы относительно высокие концентрации МЕЛ как in vitro (0.1–10.0 мМ), так и in vivo (5–200 мг/кг) [7, 42, 43]. Высокие дозы МЕЛ требуются для достижения фармакологического эффекта. Нами показано, что использование МЕЛ в достаточно высокой концентрации не приводило к изменению жизнеспособности моноцитов (рис. 3).

Известно, что, когда ЭПР-стресс становится необратимым и нормальная функция ЭПР не может быть восстановлена, инициируется апоптоз, который в итоге приводит к гибели клетки. Апоптоз, вызванный ЭПР-стрессом, включает экспрессию/активацию проапоптотических молекул, в том числе CHOP, который регулирует про- и антиапоптотические белки, такие как белки семейства Bcl-2 (BclxL, Bclw и Mcl-1) и BAK, Bах [44, 45]. Мы исследовали изменение содержания апоптотических белков Bcl-2 и Bах и наблюдали, что и сам МЕЛ, и МЕЛ совместно с АВТ-737 снижали экспрессию Bcl-2 и повышали содержание Bах (рис. 4). Кроме того, мы наблюдали повышение уровня CHOP в присутствии одного МЕЛ или МЕЛ в комбинации с АВТ-737 (рис. 5б). Предполагается, что и сам МЕЛ, и МЕЛ в комбинации с АВТ-737 в низкой концентрации активируют CHOP-опосредованный сигнальный каскад, что приводит к изменению содержания апоптотических белков Bax и Bcl-2. Полученные результаты соответствуют данным, согласно которым МЕЛ инициирует апоптоз за счет усиления активности каспаз-3, -8 и -9, изменения соотношения Bax/Bcl-2, расщепления PARP и повышения содержания белков цитохрома с, p53 и Fas-L при гепатоцеллюлярной карциноме, причем этот эффект опосредован повышением ЭПР-стресса, характеризующегося повышенной регуляцией ATF6 и CHOP [46].

Известно, что апоптоз, вызванный ЭПР-стрессом, включает активацию рецептора инозитол-1,4,5-трифосфата (IP3R) и высвобождение Са2+ через оксидоредуктин-1α (ERO1-α), индуцированный CHOP [47]. Кроме того, на изменение концентрации Са2+ в цитозоле активно реагируют различные органеллы клетки, в первую очередь митохондрии [48]. МЕЛ и его совместное применение с АВТ-737 повышали содержание цитозольного Са2+ (рис. 5а). Поступление сверхпорогового Са2+ в митохондриальный матрикс может привести к падению мембранного потенциала митохондрий и развитию окислительного стресса [49, 50]. Более того, накопление Са2+ в митохондриях может сопровождаться повышением продукции АФК [51, 52]. Мы наблюдали, что применение МЕЛ и МЕЛ + ABT-737 приводило к снижению мембранного потенциала и повышению внутриклеточной продукции АФК (рис. 6а, б). Накопленные данные показывают, что ЭПР-стресс может запускать аутофагию [26]. Кроме того, известно, что аутофагия может участвовать в гибели клеток под влиянием различных стимулов или стресса [53], а МЕЛ может принимать участие в регуляции аутофагии [36], тогда как CHOP является прямым регулятором многочисленных генов, участвующих в процессе аутофагии [54, 55]. В настоящем исследовании нами показано повышение экспрессии маркеров аутофагии под действием МЕЛ и комбинации МЕЛ + ABT-737 (рис. 6в).

Во многих видах опухолей содержание BIP повышается, защищая опухолевые клетки от стресс-индуцированного апоптоза [56], а увеличенная экспрессия PDI активно участвует в пролиферации, выживании и метастазировании некоторых типов опухолевых клеток [57]. При этом ЭПР-стресс активирует сигнальный путь, индуцирующий транскрипционный фактор CHOP, связанный с апоптозом, который активируется в сигнальном пути PERK-ATF4-CHOP [58]. Полученные нами результаты позволяют предположить, что как сам МЕЛ, так и совместно с ABT-737 в низких дозах вызывают ЭПР-зависимый стресс в клетках ОМоЛ и запускают сигнальный путь активации проапоптотического фактора CHOP, при этом уровни шаперонов BIP и PDI снижаются (рис. 7), что способствует ослаблению защиты клеток ОМоЛ от стресс-индуцированного апоптоза.

Предполагается, что механизм действия МЕЛ связан с CHOP-опосредованным повышением уровня цитозольного Са2+, который приводит к снижению мембранного потенциала митохондрий и повышению внутриклеточной продукции АФК, а активация CHOP стимулирует при этом аутофагию. Эти результаты согласуются с данными о связи CHOP с апоптозом посредством модуляции соотношения проапоптотических и антиапоптотических белков и его участии в высвобождении Ca2+ из ЭПР [47, 59]. Действие МЕЛ и его совместное применение с ABT-737 приводит к снижению содержания Bcl-2 и увеличению Bax, что, в свою очередь, предполагает запуск апоптотического каскада. В этих условиях активация CHOP модулирует аутофагию, повышая содержание маркеров LC3A/B-I, II, в то время как снижение содержания шаперонов BIP и PDI “снимает” защиту клеток ТНР-1 от индукции апоптоза. Исходя из рассмотренных данных и результатов, полученных ранее на клетках HL-60 и MV4-11, можно заключить, что совместное использование МЕЛ со сниженными дозами химиотерапевтических препаратов представляется перспективным в терапии лейкозов.

Работа выполнена в рамках госзадания Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (№ 075-01025-23-00).

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическими стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. Процедуры также были одобрены комитетом по этике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, протокол № 13/2023 от 8 февраля 2023 года. От каждого из включенных в исследование участников получено информированное добровольное согласие.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

×

作者简介

A. Lomovsky

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: ovkres@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

Yu. Baburina

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: ovkres@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

R. Fadeev

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: ovkres@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

M. Kobyakova

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics; Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: ovkres@mail.ru

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology

俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290; Novosibirsk, 630117

Ya. Lomovskaya

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: ovkres@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

R. Krestinin

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: ovkres@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

L. Sotnikova

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

Email: ovkres@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

O. Krestinina

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics

编辑信件的主要联系方式.
Email: ovkres@mail.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, Moscow Region, 142290

参考

  1. De Kouchkovsky I., Abdul-Hay M. (2016) Acute myeloid leukemia: a comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer J. 6, e441.
  2. Fernandez H.F., Sun Z., Yao X., Litzow M.R., Luger S.M., Paietta E.M., Racevskis J., Dewald G.W., Ketterling R.P., Bennett J.M., Rowe J.M., Lazarus H.M., Tallman M.S. (2009) Anthracycline dose intensification in acute myeloid leukemia. N. Engl. J. Med. 361, 1249‒1259.
  3. Coombs C.C., Tavakkoli M., Tallman M.S. (2015) Acute promyelocytic leukemia: where did we start, where are we now, and the future. Blood Cancer J. 5, e304.
  4. Guerra V.A., DiNardo C., Konopleva M. (2019) Venetoclax-based therapies for acute myeloid leukemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol. 32, 145‒153.
  5. Oltersdorf T., Elmore S.W., Shoemaker A.R., Armstrong R.C., Augeri D.J., Belli B.A., Bruncko M., Deckwerth T.L., Dinges J., Hajduk P.J., Joseph M.K., Kitada S., Korsmeyer S.J., Kunzer A.R., Letai A., Li C., Mitten M.J., Nettesheim D.G., Ng S., Nimmer P.M., O’Connor J.M., Oleksijew A., Petros A.M., Reed J.C., Shen W., Tahir S.K., Thompson C.B., Tomaselli K.J., Wang B., Wendt M.D., Zhang H., Fesik S.W., Rosenberg S.H. (2005) An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Nature. 435, 677‒681.
  6. Matthews J.P., Bishop J.F., Young G.A., Juneja S.K., Lowenthal R.M., Garson O.M., Cobcroft R.G., Dodds A.J., Enno A., Gillett E.A., Hermann R.P., Joshua D.E., Ma D.D., Szer J., Taylor K.M., Wolf M., Bradstock K.F., Australian Leukemia Study G. (2001) Patterns of failure with increasing intensification of induction chemotherapy for acute myeloid leukaemia. Br. J. Haematol. 113, 727‒736.
  7. Menendez-Pelaez A., Reiter R.J. (1993) Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J. Pineal. Res. 15, 59‒69.
  8. Pourhanifeh M.H., Mahdavinia M., Reiter R.J., Asemi Z. (2019) Potential use of melatonin in skin cancer treatment: а review of current biological evidence. J. Cell. Physiol. 234, 12142‒12148.
  9. Pourhanifeh M.H., Mehrzadi S., Kamali M., Hosseinzadeh A. (2020) Melatonin and gastrointestinal cancers: сurrent evidence based on underlying signaling pathways. Eur. J. Pharmacol. 886, 173471.
  10. Wang J., Xiao X., Zhang Y., Shi D., Chen W., Fu L., Liu L., Xie F., Kang T., Huang W., Deng W. (2012) Simultaneous modulation of COX-2, p300, Akt, and Apaf-1 signaling by melatonin to inhibit proliferation and induce apoptosis in breast cancer cells. J. Pineal. Res. 53, 77‒90.
  11. Anderson G. (2020) The effects of melatonin on signaling pathways and molecules involved in glioma: melatonin and glioblastoma: pathophysiology and treatment. Fundam. Clin. Pharmacol. 34, 189‒191.
  12. Buyukavci M., Ozdemir O., Buck S., Stout M., Ravindranath Y., Savasan S. (2006) Melatonin cytotoxicity in human leukemia cells: relation with its pro-oxidant effect. Fundam. Clin. Pharmacol. 20, 73‒79.
  13. Bejarano I., Redondo P.C., Espino J., Rosado J.A., Paredes S.D., Barriga C., Reiter R.J., Pariente J.A., Rodriguez A.B. (2009) Melatonin induces mitochondrial-mediated apoptosis in human myeloid HL-60 cells. J. Pineal. Res. 46, 392‒400.
  14. Shafabakhsh R., Mirzaei H., Asemi Z. (2020) Melatonin: а promising agent targeting leukemia. J. Cell Biochem. 121, 2730‒2738.
  15. Plaimee P., Weerapreeyakul N., Barusrux S., Johns N.P. (2015) Melatonin potentiates cisplatin-induced apoptosis and cell cycle arrest in human lung adenocarcinoma cells. Cell Prolif. 48, 67‒77.
  16. Yi C., Zhang Y., Yu Z., Xiao Y., Wang J., Qiu H., Yu W., Tang R., Yuan Y., Guo W., Deng W. (2014) Melatonin enhances the anti-tumor effect of fisetin by inhibiting COX-2/iNOS and NF-kappaB/p300 signaling pathways. PLoS One. 9, e99943.
  17. Shen Y.Q., Guerra-Librero A., Fernandez-Gil B.I., Florido J., Garcia-Lopez S., Martinez-Ruiz L., Mendivil-Perez M., Soto-Mercado V., Acuna-Castroviejo D., Ortega-Arellano H., Carriel V., Diaz-Casado M.E., Reiter R.J., Rusanova I., Nieto A., Lopez L.C., Escames G. (2018) Combination of melatonin and rapamycin for head and neck cancer therapy: suppression of AKT/mTOR pathway activation, and activation of mitophagy and apoptosis via mitochondrial function regulation. J. Pineal. Res. 64(3). doi: 10.1111/jpi.12461
  18. Gao Y., Xiao X., Zhang C., Yu W., Guo W., Zhang Z., Li Z., Feng X., Hao J., Zhang K., Xiao B., Chen M., Huang W., Xiong S., Wu X., Deng W. (2017) Melatonin synergizes the chemotherapeutic effect of 5-fluorouracil in colon cancer by suppressing PI3K/AKT and NF-kappaB/iNOS signaling pathways. J. Pineal. Res. 62(2). doi: 10.1111/jpi.12380
  19. Baburina Y., Lomovsky A., Krestinina O. (2021) Melatonin as a potential multitherapeutic agent. J. Pers. Med. 11(4), 274.
  20. Krestinina O., Fadeev R., Lomovsky A., Baburina Y., Kobyakova M., Akatov V. (2018) Melatonin can strengthen the effect of retinoic acid in HL-60 cells. Int. J. Mol. Sci. 19, 2873.
  21. Lomovsky A., Baburina Y., Odinokova I., Kobyakova M., Evstratova Y., Sotnikova L., Krestinin R., Krestinina O. (2020) Melatonin can modulate the effect of navitoclax (ABT-737) in HL-60 cells. Antioxidants (Basel). 9(11), 1143.
  22. Ломовский А.И., Бабурина Ю.Л., Фадеев Р.С., Ломовская Я.В., Кобякова М.И., Крестинин Р.Р., Сотникова Л.Д., Крестинина О.В. (2023) Мелатонин может усиливать действие препаратов, применяемых при лечении лейкемии. Биохимия. 88, 110‒124.
  23. Ломовский А.И., Бабурина Ю.Л., Кобякова М.И., Фадеев Р.С., Акатов В.С., Крестинина О.В. (2020) Мелатонин усиливает химиотерапевтическое действие цитарабина в клетках HL-60. Биол. Мембраны. 37, 103‒109.
  24. Zeeshan H.M., Lee G.H., Kim H.R., Chae H.J. (2016) Endoplasmic reticulum stress and associated ROS. Int. J. Mol. Sci. 17, 327.
  25. Huber T.B., Walz G., Kuehn E.W. (2011) mTOR and rapamycin in the kidney: signaling and therapeutic implications beyond immunosuppression. Kidney Int. 79, 502‒511.
  26. Cybulsky A.V. (2013) The intersecting roles of endoplasmic reticulum stress, ubiquitin- proteasome system, and autophagy in the pathogenesis of proteinuric kidney disease. Kidney Int. 84, 25‒33.
  27. Yuzefovych L.V., LeDoux S.P., Wilson G.L., Rachek L.I. (2013) Mitochondrial DNA damage via augmented oxidative stress regulates endoplasmic reticulum stress and autophagy: crosstalk, links and signaling. PLoS One. 8, e83349.
  28. Tsuchiya S., Yamabe M., Yamaguchi Y., Kobayashi Y., Konno T., Tada K. (1980) Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26, 171‒176.
  29. Schwende H., Fitzke E., Ambs P., Dieter P. (1996) Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. J. Leukoc. Biol. 59, 555‒561.
  30. Daigneault M., Preston J.A., Marriott H.M., Whyte M.K., Dockrell D.H. (2010) The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5. e8668.
  31. Mediavilla M.D., Cos S., Sanchez-Barcelo E.J. (1999) Melatonin increases p53 and p21WAF1 expression in MCF-7 human breast cancer cells in vitro. Life Sci. 65, 415‒420.
  32. Fornas O., Mato M.E., Webb S.M. (2000) Antiproliferative effect and cell cycle modulation by melatonin on GH(3) cells. Horm. Res. 53, 251‒255.
  33. Bejarano I., Espino J., Marchena A.M., Barriga C., Paredes S.D., Rodriguez A.B., Pariente J.A. (2011) Melatonin enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in human promyelocytic leukaemia HL-60 cells. Mol. Cell. Biochem. 353, 167‒176.
  34. Czabotar P.E., Lessene G., Strasser A., Adams J.M. (2014) Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 15, 49‒63.
  35. Bonora M., Pinton P. (2014) The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Front. Oncol. 4, 302.
  36. Boga J.A., Caballero B., Potes Y., Perez-Martinez Z., Reiter R.J., Vega-Naredo I., Coto-Montes A. (2019) Therapeutic potential of melatonin related to its role as an autophagy regulator: a review. J. Pineal. Res. 66, e12534.
  37. Kato H., Nishitoh H. (2015) Stress responses from the endoplasmic reticulum in cancer. Front. Oncol. 5, 93.
  38. Yorimitsu T., Nair U., Yang Z., Klionsky D.J. (2006) Endoplasmic reticulum stress triggers autophagy. J. Biol. Chem. 281, 30299‒30304.
  39. Akbarzadeh M., Movassaghpour A.A., Ghanbari H., Kheirandish M., Fathi Maroufi N., Rahbarghazi R., Nouri M., Samadi N. (2017) The potential therapeutic effect of melatonin on human ovarian cancer by inhibition of invasion and migration of cancer stem cells. Sci. Rep. 7, 17062.
  40. Sonehara N.M., Lacerda J.Z., Jardim-Perassi B.V., de Paula Jr R., Jr., Moschetta-Pinheiro M.G., Souza Y.S.T., de Andrade J.C.J., De Campos Zuccari D.A.P. (2019) Melatonin regulates tumor aggressiveness under acidosis condition in breast cancer cell lines. Oncol. Lett. 17, 1635‒1645.
  41. Liu L., Xu Y., Reiter R.J. (2013) Melatonin inhibits the proliferation of human osteosarcoma cell line MG-63. Bone. 55, 432‒438.
  42. Wang L., Wang C., Choi W.S. (2022) Use of melatonin in cancer treatment: where are we? Int. J. Mol. Sci. 23(7), 3779.
  43. Wang X., Wang B., Zhan W., Kang L., Zhang S., Chen C., Hou D., You R., Huang H. (2019) Melatonin inhibits lung metastasis of gastric cancer in vivo. Biomed. Pharmacother. 117, 109018.
  44. Tsukano H., Gotoh T., Endo M., Miyata K., Tazume H., Kadomatsu T., Yano M., Iwawaki T., Kohno K., Araki K., Mizuta H., Oike Y. (2010) The endoplasmic reticulum stress-C/EBP homologous protein pathway-mediated apoptosis in macrophages contributes to the instability of atherosclerotic plaques. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 1925‒1932.
  45. Iurlaro R., Munoz-Pinedo C. (2016) Cell death induced by endoplasmic reticulum stress. FEBS J. 283, 2640‒2652.
  46. Dhillon S. (2018) Ivosidenib: first global approval. Drugs. 78, 1509‒1516.
  47. Li G., Mongillo M., Chin K.T., Harding H., Ron D., Marks A.R., Tabas I. (2009) Role of ERO1-alpha-mediated stimulation of inositol 1,4,5-triphosphate receptor activity in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. J. Cell Biol. 186, 783‒792.
  48. Giorgi C., Romagnoli A., Pinton P., Rizzuto R. (2008) Ca2+ signaling, mitochondria and cell death. Curr. Mol. Med. 8, 119‒130.
  49. Pinton P., Giorgi C., Siviero R., Zecchini E., Rizzuto R. (2008) Calcium and apoptosis: ER-mitochondria Ca2+ transfer in the control of apoptosis. Oncogene. 27, 6407‒6418.
  50. Kruman I., Guo Q., Mattson M.P. (1998) Calcium and reactive oxygen species mediate staurosporine-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis in PC12 cells. J. Neurosci. Res. 51, 293‒308.
  51. Kowaltowski A.J., de Souza-Pinto N.C., Castilho R.F., Vercesi A.E. (2009) Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radic. Biol. Med. 47, 333‒343.
  52. Maciel E.N., Vercesi A.E., Castilho R.F. (2001) Oxidative stress in Ca2+-induced membrane permeability transition in brain mitochondria. J. Neurochem. 79, 1237‒1245.
  53. Kim K.W., Moretti L., Mitchell L.R., Jung D.K., Lu B. (2010) Endoplasmic reticulum stress mediates radiation-induced autophagy by Рerk-eIF2alpha in caspase-3/7-deficient cells. Oncogene. 29, 3241‒3251.
  54. Rouschop K.M., van den Beucken T., Dubois L., Niessen H., Bussink J., Savelkouls K., Keulers T., Mujcic H., Landuyt W., Voncken J.W., Lambin P., van der Kogel A.J., Koritzinsky M., Wouters B.G. (2010) The unfolded protein response protects human tumor cells during hypoxia through regulation of the autophagy genes MAP1LC3B and ATG5. J. Clin. Invest. 120, 127‒141.
  55. Ubeda M., Wang X.Z., Zinszner H., Wu I., Habener J.F., Ron D. (1996) Stress-induced binding of the transcriptional factor CHOP to a novel DNA control element. Mol. Cell Biol. 1, 1479‒1489.
  56. Kosakowska-Cholody T., Lin J., Srideshikan S.M., Scheffer L., Tarasova N.I., Acharya J.K. (2014) HKH40A downregulates GRP78/BiP expression in cancer cells. Cell Death Dis. 5, e1240.
  57. Lee E., Lee D.H. (2017) Emerging roles of protein disulfide isomerase in cancer. BMB Rep. 50, 401‒410.
  58. Nishitoh H. (2012) CHOP is a multifunctional transcription factor in the ER stress response. J. Biochem. 151, 217‒219.
  59. Fernandez A., Ordonez R., Reiter R.J., Gonzalez-Gallego J., Mauriz J.L. (2015) Melatonin and endoplasmic reticulum stress: relation to autophagy and apoptosis. J. Pineal. Res. 59, 292‒307.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. Concentration dependence of the cytotoxic effects of MEL (a) and ABT-737 (b) in THP-1 cells. The proportion of viable cells was determined 24 hours after the addition of substances by the intensity of resazurin reduction. Cells were seeded in a 96-well plate at a density of 5 × 103 cells per well and treated with substances at different concentrations. Data are presented as mean ± standard deviation (n = 6).

下载 (120KB)
索引源数据
3. Fig. 2. Viability and mitotic activity of THP-1 cells after 24 hours of incubation with MEL and ABT-737. a – Change in proliferation. b – Changes in the mitotic index in the presence of MEL and CIT. The number of viable cells in the intact culture (control, without drug treatment) was taken to be 100%. Data are presented as mean ± standard deviation (n = 6). *p < 0.05 – significant change compared to control, #p < 0.05 – significant change compared to AVT-737.

下载 (117KB)
索引源数据
4. Fig. 3. Effect of MEL on the viability of human monocytes. The cells were incubated with MEL for 24 hours. The number of living cells in the intact culture (control, without drug treatment) was taken as 100%. Data are presented as mean ± standard deviation (n = 6).

下载 (75KB)
索引源数据
5. Fig. 4. Effect of MEL and its combination with ABT-737 on the content of Bcl-2 and Bax proteins in THP-1 cells. Cells were incubated with the drugs for 24 hours. a – Immunostaining with antibodies to Bcl-2 and Bax. GAPDH was used as a protein loading control. b – Bcl-2/GAPDH ratio diagram. c – Bax/GAPDH ratio diagram. The protein level in the cell lysate without additives (100%) was used as a control. Data are presented as mean ± standard deviation (n = 4). *p < 0.05 – Significant change compared to control, #p < 0.05 – significant change compared to ABT-737.

下载 (188KB)
索引源数据
6. Fig. 5. Effect of MEL and ABT-737 on changes in cytosolic Ca2+ and CHOP content in THP-1 cells. Cells were incubated with the drugs for 24 hours. a – Change in cytosolic Ca2+ content. Fluorescence intensity of intact cells was used as a control, data are presented as mean ± standard deviation (n = 5). b – Immunostaining with antibodies to CHOP and GAPDH was used as a control for protein load. Data are presented as mean ± standard deviation (n = 4). *p < 0.05 – significant change compared to the corresponding control, #p < 0.05 – significant change compared to ABT-737.

下载 (176KB)
索引源数据
7. Fig. 6. Effect of MEL and ABT-737 on changes in ΔΨm, intracellular ROS production and autophagy markers (LC3A/B-I/II) in THP-1 cells. The cells were incubated with the drugs for 24 hours. a – Change in ΔΨm in THP-1 cells. b – Change in intracellular ROS production; data are presented as mean ± standard deviation (n = 6). c – Immunostaining with antibodies to LC3A/B-I/II, GAPDH was used as a protein load control. Data are presented as mean ± standard deviation (n = 4). *p < 0.05 – significant change compared to the corresponding control, #p < 0.05 – significant change compared to ABT-737.

下载 (279KB)
索引源数据
8. Fig. 7. Effect of MEL and its combination with ABT-737 on the content of BIP and PDI in THP-1 cells. Cells were incubated with the drugs for 24 hours. a – Immunostaining with antibodies to BIP and PDI, GAPDH was used as a protein load control. b – Diagram showing the ratio of BIP to GAPDH. c – Diagram showing the ratio of PDI to GAPDH. The protein level in the cell lysate without any additives served as a control (100%). Data are presented as mean ± standard deviation (n = 4). *p < 0.05 – significant change compared to control, #p < 0.05 – significant change compared to AVT-737.

下载 (149KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».