Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Том 59, № 4 (2025)
ОБЗОРЫ
Проникновение оболочечных вирусов в клетку как фармакологическая мишень: механизмы слияния мембран и их ингибиторы
Аннотация
Проникновение оболочечных вирусов в клетку, опосредуемое гликопротеинами слияния, представляет собой самый ранний этап вирусной инфекции, подавление которого имеет ряд преимуществ перед противовирусными средствами иных механизмов действия. Вирусные гликопротеины делятся на три класса, представители которых имеют весьма различные структуры, но сходные функциональные свойства. Все эти гликопротеины являются трансмембранными белками вириона, они обладают гидрофобной структурой (пептид или петля слияния), которая вступает в непосредственный контакт с липидной мембраной клетки-мишени при слиянии. В представленном обзоре рассмотрены механизмы слияния вирусных и клеточных мембран, опосредуемые тремя классами вирусных гликопротеинов, домены и структуры, способные служить мишенями для ингибиторов входа вируса в клетку. Также приведены примеры высоко- и низкомолекулярных ингибиторов входа, относящихся к группам блокаторов адгезии, ингибиторов взаимодействия гликопротеина с рецептором, ингибиторов заякоривания и слияния, а также соединений, блокирующих функцию внешней примембранной области. Обсуждаются перспективы разработки ингибиторов входа широкого спектра действия.
Молекулярная биология. 2025;59(4):517-543
517-543
Методы очистки синтетических олигонуклеотидов и исправления ошибок в синтетической ДНК
Аннотация
В обзоре описаны методы исправления ошибок в синтетических олигонуклеотидах и генетических конструкциях, полученных с их помощью. Обсуждены способы выделения олигонуклеотидов с совершенной структурой из олигонуклеотидных пулов. Рассмотрены способы корректировки ошибок в структуре ДНК с помощью мисматч-специфичных эндонуклеаз и белков бактериальной системы репарации ДНК. Приведены примеры практического применения разработанных методов для исправления структуры синтезируемых генетических конструкций.
Молекулярная биология. 2025;59(4):544-556
544-556
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
Влияние различных факторов на транскрипционную активность POGO-транспозонов устрицы Crassostrea gigas
Аннотация
Одной из наиболее распространенных групп ДНК-транспозонов является надсемейство pogo. В геноме тихоокеанской устрицы Crassostrea (Magallana) gigas (Thunberg, 1793) описано 10 pogo-транспозонов. В нашей работе показано, что элементы pogo устрицы относятся преимущественно к трем семействам: pogoR, Passer и Fot. Анализ геномов пяти особей устрицы выявил девять элементов pogo у всех особей, один элемент (Mariner-38_CGi) обнаружен только в двух геномных сборках. Исследованные геномные сборки различались как по числу копий pogo-транспозонов, так и по их протяженности, а также по наличию и длине инвертированных повторов. Данные по эволюционной динамике pogo-транспозонов и небольшое число их копий в геномах отдельных особей свидетельствуют о низкой активности на протяжении жизненного цикла. Анализ транскрипционной активности показал, что для элементов Mariner-30_CGi и Mariner-34_CGi более чем в половине случаев характерна постоянная или зависимая от условий экспрессия. Транскрипционная активность пяти элементов зависела от стадии развития. Предполагается, что эти элементы могли быть одомашнены (кооптированы) геномом устрицы. Это исследование расширяет наши представления об эволюции pogo-транспозонов и их роли в диверсификации геномов животных.
Молекулярная биология. 2025;59(4):557-571
557-571
Транскриптомный профиль резистентной к трастузумабу линии клеток BT-474 рака молочной железы
Аннотация
Формирование резистентности к трастузумабу при HER2-положительном раке молочной железы представляет серьезную проблему, ограничивающую эффективность таргетной терапии. В качестве модели для изучения механизмов развития устойчивости опухолевых клеток к трастузумабу выбрали HER2-положительную клеточную линию BT-474 рака молочной железы люминального B подтипа. Молекулярные механизмы резистентности изучали с использованием комплексного транскриптомного анализа, основанного на сравнении данных RNA-seq трех независимых наборов данных, включающих как чувствительные, так и резистентные к трастузумабу варианты. Проведен многоступенчатый биоинформатический анализ с последующей идентификацией регуляторных взаимодействий. В результате были идентифицированы гены с повышенной (FUCA2, HSPE1, SHLD1, NMD3) и с пониженной экспрессией (GPC5, FSTL1, ATG16L2, POLD2) в резистентных клетках. Установлены ключевые транскрипционные факторы (E2F1, MYC, YBX1, HEY1, NFIC, TFAP2A, AP-1/JUN, NCOA1), регулирующие экспрессию обнаруженных генов при развитии резистентности к трастузумабу. Выявленные изменения указывают на комплексное перепрограммирование транскрипционной активности, затрагивающее процессы, связанные с прохождением клеточного цикла, репарацией ДНК, метаболизмом и эпителиально-мезенхимальным переходом. Полученные результаты расширяют понимание молекулярных механизмов резистентности к трастузумабу и открывают перспективы для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на преодоление лекарственной устойчивости при HER2-положительном раке молочной железы.
Молекулярная биология. 2025;59(4):572-586
572-586
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
Кодон ССС пролина, предшествующий стоп-кодону, модулирует терминацию трансляции эукариот в зависимости от молекулярного окружения
Аннотация
У бактерий кодоны глицина и пролина, расположенные перед стоп-кодоном, подавляют терминацию трансляции. Однако влияние данных кодонов на терминацию трансляции у эукариот систематически не изучено. В данной работе показано, что кодон пролина ССС, предшествующий стоп-кодону, замедляет терминацию эукариотической трансляции при синтезе длинного белка. Однако при синтезе короткого пептида пролиновый кодон в этом положении, напротив, стимулирует образование терминационных комплексов. Кроме того, описана роль одного из основных регуляторов терминации эукариотической трансляции — белка PABP, связывающегося с поли(А)-хвостом мРНК, в модуляции терминации трансляции 5ʹ-контекстом стоп-кодона. Обнаружено, что при синтезе короткого пептида PABP снижает зависимость терминации трансляции от влияния 5ʹ-контекстов стоп-кодонов, а при синтезе длинного белка стимулирует терминацию трансляции независимо от 5ʹ-контекста стоп-кодона.
Молекулярная биология. 2025;59(4):587-598
587-598
Сборка комплекса незрелой 30S субъединицы рибосомы и фактора созревания Era GTPазы Staphylococcus aureus in vitro для структурных исследований
Аннотация
GTPаза Era золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) является одним из факторов созревания рибосомы. Era участвует в поздних этапах сборки малой (30S) субъединицы рибосомы и регулирует образование целой 70S рибосомы. Исследование структуры комплекса Era и 30S субъединицы S. aureus поможет в понимании процессов созревания рибосомы и механизмов регуляции синтеза белка у этого патогенного микроорганизма. В данной работе представлены протоколы получения GTPазы Era и незрелых 30S субъединиц рибосом из S. aureus, протокол сборки их комплекса для дальнейших структурных исследований методом криоэлектронной микроскопии, а также проведен предварительный сбор данных с обработкой микрографий.
Молекулярная биология. 2025;59(4):599-606
599-606
Сборка комплекса 50S субъединицы рибосомы и GTP-связывающего фактора YsxC S. aureus in vitro для структурных исследований
Аннотация
Правильная сборка и созревание рибосомных субъединиц — важнейшие процессы, обеспечивающие функциональную активность рибосом, эффективность и точность трансляции. Одним из белковых факторов, участвующих в процессах созревания большой субъединицы рибосомы, является GTP-связывающий белок YsxC, обнаруженный у многих бактерий. Известно, что в отсутствие YsxC в клетке накапливаются незрелые рибосомные интермедиаты, известные как 45S субъединицы, которые не способны взаимодействовать с малой субъединицей и формировать функционально активные рибосомы, а делеция гена ysxC летальна для Staphylococcus aureus. Механизм взаимодействия YsxC с рибосомой S. aureus остается неизученным. В данной работе разработан протокол выделения, очистки и сборки комплекса белка YsxC с 50S субъединицей рибосомы S. aureus, с использованием которого получен образец для регистрации данных просвечивающей криоэлектронной микроскопии.
Молекулярная биология. 2025;59(4):607-615
607-615
Система репарации двухцепочечных разрывов ДНК по механизму соединения негомологичных концов обеспечивает устойчивость клеток дрожжей Debaryomyces Hansenii к ДНК-повреждающему и окислительному стрессу
Аннотация
Нетрадиционные галотолерантные дрожжи Debaryomyces hansenii имеют большое значение в биотехнологии и пищевой промышленности, а в фундаментальных исследованиях служат моделью для изучения молекулярных механизмов устойчивости к повышенной солености и осмотическому давлению. Ранее нами был создан эффективный способ редактирования генома D. hansenii с помощью системы CRISPR/Cas9, появление которого стимулирует дальнейшее изучение структуры и физиологической роли путей репарации двухцепочечных разрывов ДНК у D. hansenii. Цель настоящей работы — оценить участие ключевых компонентов системы репарации двухцепочечных разрывов ДНК по механизму соединения негомологичных концов (NHEJ) в устойчивости D. hansenii к соединениям, повреждающим ДНК и вызывающим окислительный, высокосолевой и осмотический стресс. С помощью системы CRISPR/Cas9 получены мутантные штаммы с нокаутом генов DEHA2F10208g (DhKU70), DEHA2B01584g (DhKU80) и DEHA2G04224g (DhLIG4), кодирующих ключевые компоненты NHEJ. Впервые показано, что мутантные штаммы, в отличие от штамма дикого типа, чувствительны к химическим соединениям, повреждающим ДНК, а также к соединениям, вызывающим окислительный стресс. Осмотический и высокосолевой стресс, а также ванилин не вызывают существенных изменений в скорости формирования колоний мутантных штаммов. Интересно, что мутантные штаммы проявляют повышенную устойчивость к кофеину по сравнению со штаммом дикого типа. Полученные данные показывают, что система NHEJ D. hansenii играет значительную роль в ответе на ДНК-повреждающий и окислительный типы стресса. Важность системы NHEJ в процессах поддержания гомеостаза дрожжевой клетки необходимо учитывать при создании штаммов-продуцентов ценных веществ.
Молекулярная биология. 2025;59(4):616-628
616-628
Регуляция экспрессии гена компонента комплемента C3 в клетках гепатомы человека HepG2 при окислительном стрессе
Аннотация
Активные формы кислорода и азота, накапливающиеся в клетках при окислительном стрессе, вызывают повреждение различных компонентов клеток, включая ДНК, белки и липиды, и приводят, как следствие, к развитию ряда тяжелых заболеваний, таких как атеросклероз. Белок C3 является центральным компонентом каскада комплемента и важным регулятором воспалительного ответа. Провоспалительная активность C3 может также вносить вклад в развитие метаболического синдрома. Основным источником С3 в плазме крови является его синтез в гепатоцитах. Однако регуляция экспрессии гена C3 при окислительном стрессе в гепатоцитах остается неизученной. В данной работе впервые показано, что окислительный стресс, индуцированный пероксидом водорода, угнетает экспрессию гена C3 и секрецию белка C3 клетками HepG2 гепатомы человека. Идентифицирован кластер сайтов связывания транскрипционного фактора FOXO1, активирующего экспрессию гена С3, в дистальной области промотора гена С3. Кроме того, FOXO1 способен связываться с проксимальной областью промотора гена C3, образуя комплекс c фактором транскрипции HNF4α. Подавление экспрессии гена C3 в условиях окислительного стресса зависит от активации основных MAP-киназных каскадов (ERK1/2, JNK и, в меньшей степени, p38), киназы AMPK и факторов транскрипции NF-κB, HNF4α и FOXO1. Tаким образом, впервые детально изучены молекулярные механизмы, контролирующие подавление экспрессии гена C3 в клетках HepG2 в условиях окислительного стресса.
Молекулярная биология. 2025;59(4):629-645
629-645
Белок CG10543 принимает участие в регуляции транскрипции экдизон-зависимых генов
Аннотация
Несмотря на растущее количество данных о свойствах ориджинов репликации, молекулярные механизмы, лежащие в основе позиционирования комплекса ORC в геноме, ясны не до конца. Высказано предположение, что ключевыми факторами, определяющими позиционирование ORC в геноме, являются ДНК-связывающие белки, которые формируют различные регуляторные элементы ДНК, включая инсуляторы, промоторы и энхансеры, что обеспечивает связь программы репликации с различными уровнями регуляции транскрипции. Первым примером таких белков стал обнаруженный нами ранее белок Su(Hw). В ходе дальнейших работ был идентифицирован еще ряд ДНК-связывающих белков, включая CG10543, которые могут отвечать за формирование соответствующих регуляторных элементов и привлечения транскрипционных и репликационных комплексов на свои сайты связывания. Показано, что белок CG10543 дрозофилы взаимодействует c деубиквитинирующим (DUB) модулем комплекса SAGA. Сайты связывания белка CG10543 расположены преимущественно в промоторных областях активных генов и колокализуются с комплексами модификации и ремоделирования хроматина SAGA и dSWI/SNF, а также с репликационным комплексом ORC. С целью изучения роли белка CG10543 в регуляции транскрипции провели RNA-Seq-эксперимент в клетках S2 дрозофилы как в норме, так и при РНК-интерференции CG10543. Показали, что белок CG10543 влияет на транскрипцию 469 генов, причем существенная часть этих генов (23%) относится к экдизон-зависимым. Экдизон – это основной стероидный гормон дрозофилы, ответственный за метаморфоз и оказывающий существенное влияние на экспрессию множества генов в процессе развития дрозофилы. Нами показано, что сайты CG10543 колокализуются с белком CBP и гистоновой меткой H3K27Ac, что характерно для активных регуляторных элементов. Белок CG10543 также колокализуется с белком CP190, что может свидетельствовать о регуляции транскрипции посредством дальних взаимодействий между регуляторными элементами.
Молекулярная биология. 2025;59(4):646-654
646-654
Оптимизация продукции рекомбинантного аденоассоциированного вируса 9 серотипа
Аннотация
Векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) зарекомендовали себя как удобный инструмент геномного редактирования. Однако для трансгенеза лабораторных животных или генной терапии заболеваний человека требуется высокий титр AAV, в получении которого заключается основная трудность. Мы провели оптимизацию условий получения AAV серотипа 9 (AAV9) с целью повышения выхода вируса. Широко распространенный подход подразумевает трансфекцию клеток-продуцентов тремя плазмидами. Мы провели трансфекцию двумя плазмидами, кодирующими все необходимые компоненты для продукции AAV9. Это позволило повысить итоговый титр в четыре раза. Оптимизация по молярному соотношению плазмиды, содержащей ген интереса, и плазмиды, кодирующей белки репликативного комплекса, капсида и вспомогательных факторов, привела к двукратному повышению титра. Оптимизация состава производственной среды для продукции ААV9 позволила существенно повысить выход вируса. При замене производственной среды DMEM-F12 на менее питательную – DMEM – с добавкой эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота выход AAV9 увеличился почти на 3 порядка. Таким образом, оптимизация числа и соотношения плазмид, а также состава производственной среды позволили многократно повысить продукцию ААV9 и достичь итогового титра в 2.5 × 1012 векторных геномов в 1 мл культуральной среды адгезивных клеток линии HEK293Т.
Молекулярная биология. 2025;59(4):655-662
655-662
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
Безметочный оптический биосенсор для изучения кинетики связывания умных наноматериалов с лигандами
Аннотация
Стимулчувствительные интеллектуальные материалы, активируемые при воздействии входных сигналов, представляют большой интерес для анализа биохимических данных в диагностике и терапии. Для разработки интеллектуальных тераностических агентов на основе наноматериалов необходимо изучать аффинность взаимодействия и кинетику связывания агентов с поверхностью биочипа. Нами разработан безметочный интерферометрический биосенсор для анализа кинетики связывания интеллектуальных наноматериалов с поверхностью биочипа. Используя разработанный биосенсор, мы оптимизировали работу молекулярных маяков на наночастицах. Для этих умных материалов продемонстрировано семикратное увеличение константы скорости при переходе молекулярных маяков из состояния “выкл” (без лигандов) в состояние “вкл” (в присутствии ДНК-аналита). Это изменение константы скорости использовано для разработки кинетического биосенсора, способного обнаруживать входные фрагменты ДНК с порогом детекции 50 ± 10 пМ и линейным динамическим диапазоном в 3 порядка. Разработанные молекулярные маяки на наночастицах открывают новые возможности для создания усовершенствованных тераностических нанороботов – благодаря их высокой чувствительности к анализируемым соединениям и эффективному функционированию при физиологической ионной силе. Последнее их выгодно отличает от ранее разработанных наномаяков, которые эффективны только в растворах с высоким содержанием солей. В перспективе биосенсор может быть использован в качестве диагностического инструмента следующего поколения.
Молекулярная биология. 2025;59(4):663-676
663-676