Molecular Ion Channel Blockers of Influenza A and SARS-CoV-2 Viruses

Толық мәтін

ВВЕДЕНИЕ

Последнее столетие (1918–2019 гг.) известно серьезными эпидемиями гриппа А (https://www.cdc.gov/flu/pandemic-resources/1918-commemoration/1918-pandemic-history.html) (испанка: 1918–1922 гг.) и атипичной пневмонии (ковид-19: 2019–2023 гг.), вызванные вирусами H1N1 [1] и SARS-CoV-2 (https://www.who.int/news-room/questions-and-answers/item/SARS-CoV-2-evolution) соответственно. Поэтому разработка эффективных противовирусных препаратов остается задачей большой важности из-за способности этих вирусов быстро инфицировать большие популяции, преодолевая межвидовые барьеры путем быстрых мутаций. Известно значительное количество мутантных форм мембранного белка M^pro, формирующего поверхностные шипы вирусов гриппа А H1N1 [1, 2], и белка M^pro вируса SARS-CoV-2 [3, 4]. Лекарственный препарат, эффективный в том числе против мутантных штаммов, должен воздействовать на функционально значимые, но структурно консервативные элементы вируса. Консервативным структурным функционально значимым элементом вирусов являются ионные каналы – М2 вируса гриппа А и Е-канал вируса SARS-CoV-2. Известны атомные структуры высокого разрешения ионных каналов вирусов гриппа А, канал М2 (код PDB2KAD) [5, 6] и канал Е вирусов SARS-CoV-2 (PDB код 5X29), что дает возможность конструировать молекулы блокаторов этих каналов [7, 8]. Функциональная значимость каналов М2 и Е состоит в транспорте ионов H⁺/K⁺ через липидную мембрану вирусов гриппа А и SARS-CoV-2. Диаметр М2-канала вируса гриппа А составляет 4–6 Å, тогда как диаметр Е-канала SARS-CoV-2 варьирует в пределах 4–9 Å.

Важность функциональности ионных каналов для вирулентности показана на нескольких вирусах. Например, активность протонного канала белка М2 вируса гриппа А имеет решающее значение для проникновения вируса через клеточную мембрану и инфицирования клетки [9]. Активность канала белка E коронавируса SARS-СoV-2 необходима для инфицирования живой клетки [10]. А патогенность вируса инфекционного бронхита значительно снижается, когда трансмембранный сегмент белка E заменяли гетерологичным доменом, у которого отсутствовала активность ионного канала [10]. Важность Е-каналов для вирулентности и способности вызывать заболевание показана на нескольких вирусах: после эндоцитоза Е-канал облегчает перенос ионов H⁺ и K⁺ во внутренний объем вируса [11], позволяя вирусной РНК инициировать репликацию. Показано, что канальная активность белка E имеет решающее значение для инфекционности РНК коронавирусов [12]. Оказалось также, что вирусы SARS-CoV-1, у которых блокирована активность белка E, были гораздо менее заразными [11, 12]. Белок Е участвует в сборке, высвобождении и патогенезе вируса [13, 14]. В целом, каналы М2 и Е это небольшие гидрофобные вирусные белки, которые встраиваются в клеточную мембрану, облегчая тем самым высвобождение вируса из инфицированных клеток. Показано, что активность Е-каналов нескольких коронавирусов, включая SARS-CoV-1 [15–17], коронавирус MERS [18], коронавирус HCoV-225 человека, вирус гепатита мыши и вирус инфекционного бронхита [19], может быть заблокирована гексаметиленамилоридом [20, 21]. Активность М2- или E-каналов вирусов гриппа А и SARS-CoV-2 имеет решающее значение для процесса заражения живой клетки [22–24]. Диффузия протонов Н⁺ через М2- и Е-каналы может быть стерически блокирована связыванием электронейтральной молекулы блокатора внутри ионного канала [25, 26]. Более эффективное блокирование может быть достигнуто путем связывания положительно заряженной молекулы, создающей как стерическое блокирование, так и дополнительный электростатический барьер для положительно заряженных ионов Н⁺ и K⁺ [27–29].

В настоящей работе суммированы результаты наших работ [6, 27–29], в которых предложена серия молекул, блокирующих ионные каналы нативных и наивероятных мутантных белков М2 вируса гриппа А и белка E вирусов SARS-CoV-2. Показано, что молекулы, производные 1,4-диазабицикло-[2.2.2]октана (DABCO), эффективно связываются внутри М2- и E-каналов вирусов гриппа А и SARS-CoV-2, блокируют проницаемость для протонов и ионов К⁺ как стерически, так и электростатически, нарушая транспорт ионов и жизнеспособность вирусов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Метод моделирования. Атомную структуру и тепловую динамику белков М2 и E при физиологической температуре (308 К) моделировали, исходя из известных экспериментальных данных. Моделирование равновесной структуры нативных белков М2 и Е, в также их наивероятных мутантных форм выполнено методом молекулярной динамики (МД).

Моделирование равновесных тепловых флуктуаций трехмерных структур выполнено программным комплексом BioPASED [30–32] с неявной моделью среды, описываемой обобщенной корректированной моделью Борна GB-MSR6с [33, 34].

Энергия биополимера в растворе U:

U = E_bond + E_angel + E_tors + E¹⁴ _vdw + E_vdw + E_elect + E_Hbond + E_solv,

где E_bond, E_angel и E_tors описывают энергию деформации валентных связей; E¹⁴ _vdw и E_vdw описывают парные Ван-дер-Ваальсовы (ВДВ) взаимодействия атомов, разделенных тремя и более валентными связями; энергии электростатических взаимодействий (E_elec) пар атомов, разделенных тремя и более валентными связями, отличные от нуля в радиусе 15 Å, рассчитаны методом обобщенного поля реакции; энергия водородных связей E_Hbond рассчитывается как X–H⋅⋅⋅Y между атомом водорода H, присоединенным к электроотрицательному атому X-Н, и электроотрицательным атомом-акцептором Y. Функциональная форма включает зависимость от угла между X–H и Н⋅Y, уменьшаясь при искривлении водородной связи; энергию сольватации (E_solv) вычисляют по модели гауссовских гидратных оболочек, вычислительно эффективной и разумно точной.

Структура М2-канала с молекулой амантадина, связанной в канале, получена методом ЯМР, код 2KAD, при T = 243K, рН 7.5. Молекулу амантадина удалили из ионного канала M2, затем структуру канала оптимизировали методом симуляции отжига, т. е. выполняли нескольких циклов медленного разогрева системы до 400К и охлаждения до 300К.

Динамическая структура М2-канала получена как серия структур вдоль равновесной МД траектории длительностью 25 нс с временным интервалом 100 пс. Эта серия структур позволяет моделировать динамическое связывание молекул блокаторов флуктуирующей структурой М2-канала. Отметим, что при комнатных температурах позиционные флуктуации атомов белка более 1Å, как это следует из серии структур, полученных методом ЯМР, код 2KAD. Равновесные МД траектории при постоянном нейтральном рН 6.5 моделировали с периодическим уточнением ионизационных состояний ионизируемых аминокислотных остатков молекулы белка М2, содержащей четыре остатка гистидина, рК₀ которых близка к физиологическому интервалу величин рН организма человека.

Структура E-канала вируса SARS-CoV-2, PDB код 5X29, получена методом ЯМР при температуре 308К, рН 5.5 – 16 моделей, которые отражают тепловую динамику среднеквадратичным отклонением атомов в пределах 2.6 Å, т. е. умеренную тепловую динамику молекулы при физиологических температурах. Динамическая структура Е-канала для моделирования взаимодействия с молекулами блокаторов получена как серия структур вдоль равновесной траектории метода МД длительностью 100 нс.

Расчеты значений констант ионизации pK_a и степени ионизации в зависимости от рН растворителя выполнены методами FAМВE и FAMBE-pH [31, 32]. Расчет степени ионизации аминокислот белков в растворе основан на минимизации энергии молекулы белка в данной конформации, зависимой от степени ионизации, по ее величине. Достоверность метода расчета pK_a в пределах 1.0 ед. показана для 297 ионизируемых групп в 32 белках [34].

Расчеты энергии межатомных взаимодействий выполнены в силовом поле AMBER94 и AMBER-GAFF [35–37]. Выполнен слепой исчерпывающий докинг молекул, который состоит из нескольких этапов [38]: (1) предварительный поиск всех возможных сайтов связывания на поверхности белка, доступной для молекулы лиганда; (2) селекция этих сайтов по контактному рангу, числу атомов белка, находящихся в контакте с атомами лиганда; (3) для всех сайтов с большим контактным рангом выполняется глобальная оптимизация полной энергии связывания лиганда по положению, ориентации и конформации лиганда, локальной структуре белка. Глобальная оптимизация структуры белка со связанным лигандом достигается стартом из 72 ориентаций лиганда, равномерно распределенных в пространстве ориентаций, методом симуляции отжига, т. е. выполняется МД комплекса белок-лиганд с несколькими циклами медленного нагревания до 400–500К и охлаждения до целевой температуры.

Белки, образующие М2- и E-каналы, встроены в липидную мембрану клетки, моделированную эффективной средой. Экспериментальные данные показывают, что диэлектрическая проницаемость липидной мембраны (т. е. вне объема белка E или М2), D_out равна ~30 [39]. При моделировании электростатических взаимодействий атомов структур каналов внутренний объем каналов М2 и Е рассматривается как объем белка с диэлектрической проницаемостью D_in, равной 12 [40–43].

Ингибиторы ионных каналов белков М2 и E. Трехмерные структуры белков М2 (код PDB2KAD) и Е-каналов (код PDB5X29) определены методом ЯМР и содержат все атомы водорода. Структура М2-канала образована четырьмя α-спиралями – остатки 22–46 каждой из цепей A, B, C, D [5]. Наиболее известными блокаторами ионного канала М2 являются амантадин и ремантадин [44, 45]. Существуют блокаторы ионного канала с более сложными структурами, например, производные пикротоксина [46], производные адамантана и спиро-адамантиламин [47]. МД-моделирование показало, что профиль свободной энергии иона Н⁺ при движении вдоль ионного канала М2 имеет энергетический барьер ~5 ккал/моль [48]. Моделирование методом МД потенциальной энергии связывания амантадина с неявной моделью растворителя и окружающей среды, т. е. объема клеточной мембраны, предсказывает величину энергии связывания ~ 4 ккал/моль, что удовлетворительно соответствует экспериментальным данным [49].

Рис. 1. Структура молекул блокаторов Е- и М2- каналов. a – DABCO; б – DABCOB; в – DABCO3B; г – DABCON; д – DABCO3N.

Новый класс молекулярных ингибиторов М2- и Е-каналов сконструирован на основе базовой молекулы диазабициклооктана (DABCO), рис. 1а, которая служит первичным соединением [24]. Предложенные модификации DABCO значительно увеличивают вероятность связывания внутри М2- и Е-каналов вирусов гриппа А и SARS-CoV-2.

Полициклические производные диазабициклооктана. Полициклические производные молекулы DABCO, рис. 1а, состоят из большего числа атомов, чем исходная молекула, поэтому они могут иметь более сильные Ван-дер-Ваальсовы и электростатические взаимодействия с внутренней поверхностью каналов М2 и E. Рассмотрен набор молекул блокаторов, состоящих из большего числа атомов, чем в молекуле DABCO. Молекулы диазабициклооктанбензола (DABCOB), рис. 1б, и диазабициклооктаннафталина (DABCON), рис. 1 г. Более объемные молекулы, диазабициклооктан-3-бензол (DABCO3B) и диазабициклооктан-3-толуол (DABCO3N), рис. 1в и рис. 1д, получены модификацией циклической структуры корневой молекулы DABCO в трех симметричных направлениях.

Таблица 1. Средняя заселенность ионизационных состояний остатков гистидина (His34A, His34B, His34C, His34D) белка M2

Примечание. Приведена средняя заселенность ионизационных состояний остатков гистидина; в скобках – величины среднеквадратичных (RMSD) флуктуаций.

Следует отметить, что конструирование ингибитора М2- и Е-каналов как жесткой полициклической структуры более предпочтительно, по сравнению с гибкой структурой, поскольку при связывании и дополнительном ограничении конформационной подвижности молекулы лекарственного препарата наблюдается меньшая потеря конформационной энтропии по сравнению с подвижностью свободной молекулы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Связывание DABCO и его производных с нативным М2 каналом

Ионный канал М2 образован сегментами аминокислотных остатков 24–46 каждой из четырех α-спиралей (A, B, C, D) с центральным продольным каналом [46, 47]. Вероятность транспорта протона через канал M2 незначительно меняется в области значений рН 5.4–7.0 [48]. Структурные данные показывают, что аминокислотные остатки Val27, Аla30, Ser31 и Gly34, важные для транспорта протона и взаимодействия с молекулой амантадина, блокирующей канал М2, лежат на внешней стороне каждой из α-спиралей (A, B, C, D) [50, 51]. Мутация этих остатков с большой вероятностью будет влиять на транспорт протона через канал М2.

Известны несколько атомных структур пустого канала М2 (PDB коды 2H95, 2L0J, 4QKL, 4QKM и 2KAD), полученных методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа. ЯМР-структура (PDB код 2KAD), полученная при 243К и рН 7.5 [52–54], включает все атомы водорода, т. е. дает полную информацию об ионизационном состоянии остатков и типе таутомера нейтральных остатков гистидина. Вход в ионный канал М2 образован четырьмя остатками серина, Ser31A, Ser31B, Ser31C и Ser31D, которые контролируют диффузию ионов Н⁺ через канал. Четыре остатка гистидина – His37A, His37B, His37C и His37D – лежат в одной плоскости, перпендикулярной к оси ионных каналов М2, и находятся в форме нейтрального таутомера HE2 (или HIE, как принято в структурном моделировании). Средняя потенциальная энергия белка M2 вдоль равновесной МД траектории для ионизированного и нейтральных состояний четырех остатков гистидина приведена в табл. 1–3. Видно, что различия средних потенциальных энергий <E_pot> MD белка М2 для ионизированного состояния HIS⁺ и нейтрального состояния HIE составляет ~6 ккал/моль. Средняя величина тепловых флуктуаций энергии таутомера HIE по равновесной МД траектории длительностью 25 нс, равна ~12 ккал/моль. Заселенности заряженных и нейтральных состояний четырех остатков гистидина заметно флуктуируют вдоль МД траектории (рис. 2).

Рис. 2. Ионизированная HIS+-фракция остатков гистидина (а) и фракции нейтрального таутомера HIE (б). His37A (черный цвет), His37B (красный), His37C (синий), HIS37D (зеленый), белка М2 при рН 6.5, Т =300К, вдоль равновесной МД траектории в 25 нс.

Однако средние значения долей заселенностей ионизированного и нейтральных форм остатков His37A, His37B, His37C и His37D равны в пределах 0.04–0.06 (табл. 3). Ионизированное состояние остатков гистидина, HIS⁺ и нейтральный таутомер HIE при рН 6.5, реализуются с вероятностями 0.64 и 0.32 соответственно (табл. 3). Средняя потенциальная энергия <E_pot>_MD белка М2 с нейтральным таутомером HID значительно больше (на ~50 ккал/моль) энергии состояний остатков гистидина HIS⁺ и HIE (табл. 3), а вероятность состояний HID мала ~ 0.02–0.04. Средняя пространственная структура нейтрального состояния канала M2 незначительно отличается, в пределах амплитуды тепловых флуктуаций ~ 0.9 Å, от экспериментальной структуры канала М2 (PDB2KAD).

Таблица 2. Энергии молекулы белка M2 при ионизированном и нейтральном состоянии остатков гистидина, Т = 300K

Таблица 3. Средние значения pK_a и доли фракций ионизированных и нейтральных таутомеров остатков гистидина белка М2 вдоль равновесной МD траектории при pH 6.5, T = 300K

Примечание. Приведены средние значения; в скобках – величины RMSD флуктуаций.

Можно отметить, что среднеквадратичное отклонение (RMSD) для положений атомов Oγ остатков Ser31A, Ser31В, Ser31С, Ser31D для структуры канала M2 вдоль траектории MД не превышало 1.1 Å. Например, расстояния между атомами Oγ остатков Ser31A/Ser31C и Ser31B/Ser31D колеблются в пределах 8.4–9.5 Å. Выход из канала М2 контролируется остатками гистидина His37A, His37B, His37C, His37D и характеризуется флуктуациями попарных расстояний между ближайшими атомами C^ε₁ и N^ε₂ в парах His37A–His37B, His37B–His37C, His37C–His37D, His37D–His37A, в диапазоне 4.5–5.4 Å. Средние значения pK_a (табл. 3) остатков гистидина смещены на 0.3 единицы в сторону высоких значений рН, <pK_a> ~6.8, (pK₀ = 6.5). Следовательно, остатки гистидина имеют незначительный отрицательный электростатический потенциал, который стабилизирует ионизированное состояние H⁺ на ~8 ккал/моль (табл. 2). Значительные величины тепловых флуктуации энергий состояний НIS⁺ и HIE, ~15 и 12 ккал/моль (табл. 2), способствуют процессу переноса протона через “гистидиновый затвор” – квартет остатков His37A, His37B, His37C, His37D ионного канала М2. Параметры связывания молекул блокаторов, производных DABCOB, с ионным каналом М2, приведены в табл. 4.

Таблица 4. Энергия оптимальных сайтов связывания производных молекулы-блокатора DABCO с нативным М2-каналом

Оптимальная мода связывания, блокирующая М2-канал, приведена на рис. 3. Эти данные показывают, что оптимальная молекула-блокатор DABCOB имеет высокую энергию связывания внутри М2-канала с образованием двух сильных водородных связей (рис. 3) остатками SER31A(С) либо HIE37A(D). Связывание вне канала М2 может происходить с вероятностью ~ 0.32.

Рис. 3. Основной сайт связывания молекул DABCOB c нативным M2-каналом.

Оценочная вероятность мутации остатков SER31A(B, C, D) канала М2 в отличный от SER остаток, влияющий на свойства канала, достаточно высока ~ 0.14 [57]. Мутации остатков SER31 в четырех альфа-цепях белка М2, образующих внутреннюю поверхность канала М2, в остатки THR, ASN, ALA, GLU, CYS, случаются с вероятностями 38, 34, 28, 17 и 16 × 10^–4 соответственно [55]. Расчеты энергий связывания молекул-блокаторов с мутантными М2-каналами приведены в табл. 5. Видно, что оптимальным сайтом связывания остается блокирующая позиция внутри канала М2, аналогичная позиции в нативном М2-канале. Энергии связывания незначительно (~ 1.5–2.0 ккал/моль) выше, чем в нативном М2- канале (табл. 5).

Таблица 5. Энергии связывания оптимального блокатора DABCOB с нативными и мутантными структурами М2-канала

Связывание DABCO и его производных с Е-каналом

Подготовка набора оптимизированных низкоэнергетических белковых структур Е-канала к моделированию связывания молекул блокаторов выполнена методом, описанным, в разделе Метод моделирования.

Рис. 4. Флуктуации потенциальной энергии нативной и мутантных структур Е-канала при T= 308K, pH 6.5; черный — нативная структура, красный — mut1, зеленый – mut2.

Рассмотрены нативная и две мутантные структуры белка E, нативная, mut0, содержащая GLU8A(B, C, D, E) и ASN15A(B, C, D, E), mut1 с остатками GLU8A(B, C, D, E), ASP15A(B, C, D, E) и mut2 с остатками GLN8A(B, C, D, E) и ASN15A(B, C, D, E). Мутантные структуры позволили выяснить влияние кислотных, отрицательно заряженных остатков на структуру входа в Е-канал. Равновесные МД траектории при комнатной температуре, 308K, длительностью 100 нс для нативной и мутантных форм Е-канала показаны на рис. 4. В табл. 6 приведены значения средних энергий и амплитуды флуктуаций потенциальной энергии структур. Средние амплитуды флуктуаций находятся в пределах 53.2 (mut0), 50.1 (mut1), 44.3 (mut2), ккал/моль для нативной и двух мутантных структур. Видно, что нативная структура, mut0, с GLU8A(B, C, D, E) и ASN15A(B, C, D, E) имеет минимальную потенциальную энергию вдоль равновесной МД траектории по сравнению с мутантными mut1 с GLU8A(B, C, D, E), ASP15A(B, C, D, E) и mut2 с остатками GLN8A(B, C, D, E) и ASN15A(B, C, D, E). Средние значения энергии с мутантных структур mut1 и mut2 больше на 30.1 и 94.4 ккал/моль соответственно.

Таблица 6. Средние энергии нативной и мутантных структур Е-белка при T= 308K

Флуктуирующие потенциальные энергии нативной структуры mut0 и мутантных структур mut1 демонстрируют наибольшую степень взаимного перекрытия (рис. 4). Значительное перекрытие потенциальных энергий вдоль МД траекторий показывает, что нейтральные остатки ASN15A(B, C, D, E) могут с большой вероятностью спонтанно превращаться в отрицательно заряженный аминокислотный остаток ASP15A(B, C, D, E).

Переход между нейтральным и заряженным состояниями остатков может происходить в различных комбинациях, ионизированный/нейтральный в каждой из пяти субъединиц. Следовательно, появляется новая степень свободы, т. е. состояние ионизации ASN/ASP, у пяти остатков ASP15A(B, C, D, E), что приводит к уменьшению энтропии ионизационного состояния на ~ -kT×lnN_iz, где N_iz =2⁵ — это количество ионизационных состояний пяти остатков ASN15/ASP15(A, B, C, D, E). Большое перекрытие флуктуаций энергий нативных, mut0, и мутантных, mut1, структур, повышает вероятность спонтанных переходов между нативной структурой и mut1. Перекрытие энергий между нативным и мутантными, mut2, состояниями мало, поэтому спонтанные переходы в нейтральное состояние остатков GLU8A(B, C, D, Е) при нейтральных остатках ASN15A(B, C, D, Е) маловероятно. Результаты докинга бициклических и трициклических производных DABCO на нативный белок E показаны на рис. 5 и в табл. 7.

Рис. 5. Структура наивероятных, с наибольшей энергией связи, комплексов нативного Е-канала с оптимально связанными молекулами блокаторов: DABCO (а); DABCOB (б); DABCO3B (в); DABCON (г); DABCO3N (д).

Таблица 7. Сайты связывания производных DABCO с нативным, mut0, E-белком вируса SARS-CoV-2 [Glu8^–Asn15(A, B, C, D, E)]

Связывание полициклических производных DABCO с мутантными структурами Е-каналов

Мутации аминокислотных остатков белка E, образующих внутреннюю поверхность канала, ASN15/ASP15 и GLU8/GLN8 случаются с вероятностями 42 × 10^–4 и 35 × 10^–4 соответственно [55]. Рассмотрены два наивероятных мутанта нативного Е-канала, mut1, мутация ASN15/ASP15 во всех цепях (A, D, C, D, E) белка E и мутант mut2, GLU8/GLN8. Мутантные структуры стабильны при длительном моделировании методом МД (рис. 4).

Рис. 6. Структура наивероятных комплексов мутантного, mut1, Е-канала с оптимально связанными молекулами блокаторов: DABCO (а), DABCOB (б), DABCO3B (в), DABCON (г), DABCO3N (д).

Средние энергии по траекториям MД обеих мутантных структур выше, чем у нативного белка E, mut1 менее выгодна на 30.1, а мутант mut2 на 94.4 ккал/моль (табл. 6). Амплитуды тепловых флуктуаций потенциальных энергий, по траекториям MД, составляют 53.2 (для mut0), 50.1 (mut1), 47.3 (mut2), ккал/моль. Достаточно большие амплитуды тепловых флуктуаций потенциальных энергий структур mut0 и mut1 и их перекрытие (рис. 4) свидетельствуют, что мутанты mut0 и mut1 могут спонтанно переходить один в другой, ASN15/ASP15, с высокой вероятностью при комнатной температуре.

Таблица 8. Сайты связывания производных DABCO с мутантным, mut1, E-белком вируса SARS-CoV-2 [Glu8^–Asp^-15(A, B, C, D, E)]

Рис. 7. Структура наивероятных комплексов мутанта Е канала, mut2, с молекулами блокаторов: (а) DABCO; (б) DABCOB; (в) DABCO3B; (г) DABCON; (д) DABCO3N.

Основные моды связывания молекул блокаторов DABCO, DABCOB, DABCO3B, DABCON и DABCO3N с белком Е и энергии их взаимодействия с мутантом mut1 приведены на рис. 6 и в табл. 8. Отметим, что наиболее сильной модой связывания для всех пяти лигандов (рис. 1) являются структуры с лигандом внутри Е-канала. Энергии связывания молекул блокаторов с мутантом mut1 (ASN15/ASP15) больше на ~5–11 ккал/моль, по сравнению с энергиями связывания с нативным белком Е. Это связано с положительным зарядом лигандов (+2 e. u.), производных DABCO и возрастания электростатических взаимодействий с мутантными отрицательно заряженными остатками ASP15(A, B, C, D, E). Основные сайты связывания характеризуются образованием двух водородных связей между ASP15 из двух разных белковых цепей Е-канала (табл. 8) с двумя атомами азота молекул лигандов (рис. 6). Табл. 8 показывает, что молекулы DABCO3B и DABCO3N связываются наиболее сильно со внутренней поверхностью канала E, тогда как более простые DABCOB и DABCON связаны заметно слабее, на 13–15 ккал/моль. Увеличение энергии связывания внутри Е-канала обусловлено более сильными электростатическими и Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями положительно заряженных молекул блокатора с мутантным, mut1 ASN15/ASP15, Е-каналом (табл. 8).

Второй вероятный мутант E-канала, mut2, GLU8/GLN8, во всех пяти цепях A, B, C, D, E характеризуется заменой заряженных кислотных остатков GLU8 (A, B, C, D, E) на нейтральные GLN8. Моделирование мутанта GLU8/GLN8 показывает заметное увеличение энергии структуры mut2 на ~ 60 ккал/моль относительно энергии мутанта mut1 и на ~90 ккал/моль относительно нативного белка E. Структуры сайтов, предпочтительных по энергии связывания, для пяти молекул лигандов DABCO, DABCOB, DABCO3B, DABCON, DABCO3N, с мутантом mut2 E-канала приведены в табл. 9. Наиболее предпочтительные структуры связывания пяти молекул блокаторов с мутантным, mut2, Е-каналом показаны на рис. 7. Видно, что только молекула блокатора, DABCO3N, имеет сайт связывания внутри канала Е (табл. 9) с энергией, близкой к энергии оптимального сайта связывания вне канала. То есть молекула блокатора DABCO3N, связываясь в Е-канале, может блокировать канал с вероятностью ~1/2.

Анализ результатов для мутанта Е-канала, mut2, табл. 9 и сравнение с расчетами для нативной, mut0, структуры с зарядом 1 e. u., мутантом mut1 с зарядом 2 e. u., показывает, что нейтральный мутант, mut2, Е-канала обладает наименьшей вероятностью связывания молекул блокаторов внутри Е-канала. Можно отметить, что энергия связывания молекулы лиганда DABCO3N линейно коррелирует с зарядами остатков, формирующих вход в Е-канал, энергии равны –61.5, —58.1 и –54.6 ккал/моль, соответственно, для структур mut1, mut0, mut2, имеющих заряды –2, —1 и 0 e. u. соответственно.

Таблица 9. Сайты связывания производных DABCO с мутантным, mut2, E-каналом вируса SARS-CoV-2 [Gln8Asn15]

Анализ результатов, представленных в табл. 6–9, показывает, что для положительно заряженных +2 e. u., молекул блокаторов DABCO, DABCOB, DABCO3B, DABCON, DABCO3N критически важны электростатические взаимодействия с нативной и мутантными структурами ионного канала E. Вероятность захвата ионов H⁺/K⁺ в канал Е с последующей диффузией ионов вдоль канала будет значительно снижена для нейтрального мутанта mut2, по сравнению со связыванием для заряженных нативной, —1 e. u., и mut1, —2 e. u., структур Е-канала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе представлены результаты конструирования молекул лекарственных препаратов, положительно, +2 e. u., заряженных производных диазабициклооктана, которые могут эффективно связываться внутри М2- и Е-каналов вирусов гриппа А и SARS-CoV-2 и блокировать транспорт ионов H⁺/K⁺ через клеточную мембрану, нарушая функционирование вирусов. В физиологических условиях проведено моделирование тепловой динамики структур нативных белков, формирующих М2- и E-каналы, а также наиболее вероятных мутантных структур каналов. Методом исчерпывающего докинга определены наиболее вероятные позиции и энергии связывания серии положительно заряженных молекул блокаторов с нативными и мутантными структурами М2- и Е-каналов в физиологических условиях. Определены оптимальные структуры молекул блокаторов, связывающихся в М2- и Е-каналах с высокой энергией, 30–50 ккал/моль.

Исследование поддержано грантом РФФИ № 18-04-00005-a и бюджетным проектом, финансируемым Правительством Российской Федерации для Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук: № АААА-А17-117020210022-4.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Авторлар туралы

Yu. Vorobjev

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: ynvorob@niboch.nsc.ru
Ресей, Novosibirsk, 630090

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар

Әрекет

1. JATS XML

Жүктеу

2. Fig. 1. Structure of molecules of E- and M2-channel blockers. a – DABCO; b – DABCOB; c – DABCO3B; g – DABCON; d – DABCO3N.

Жүктеу (319KB)

Метадеректер

3. Fig. 2. Ionized HIS+ fraction of histidine residues (a) and fraction of neutral tautomer HIE (b). His37A (black), His37B (red), His37C (blue), HIS37D (green), protein M2 at pH 6.5, T = 300 K, along the equilibrium MD trajectory in 25 ns.

Жүктеу (368KB)

Метадеректер

4. Fig. 3. The main binding site of DABCOB molecules with the native M2 channel.

Жүктеу (79KB)

Метадеректер

5. Fig. 4. Fluctuations of potential energy of native and mutant structures of the E-channel at T= 308K, pH 6.5; black – native structure, red – mut1, green – mut2.

Жүктеу (213KB)

Метадеректер

6. Fig. 5. Structure of the most probable, highest binding energy, complexes of the native E-channel with optimally bound blocker molecules: DABCO (a); DABCOB (b); DABCO3B (c); DABCON (d); DABCO3N (d).

Жүктеу (823KB)

Метадеректер

7. Fig. 6. Structure of the most probable complexes of the mutant, mut1, E-channel with optimally bound blocker molecules: DABCO (a), DABCOB (b), DABCO3B (c), DABCON (d), DABCO3N (d).

Жүктеу (946KB)

Метадеректер

8. Fig. 7. Structure of the most probable complexes of the E channel mutant, mut2, with blocker molecules: (a) DABCO; (b) DABCOB; (c) DABCO3B; (d) DABCON; (d) DABCO3N.

Жүктеу (1MB)

Метадеректер