Нокаут-мутации в генах, кодирующих переносчики фосфата, нарушают адаптацию Saccharomyces cerevisiae к потреблению этанола

Полный текст

Изучение адаптации клеток дрожжей к этанолу является важной задачей для оптимизации биотехнологий, связанных с виноделием (Эльдаров и соавт., 2016) и производством технического этанола (Розанов и соавт., 2014). Методами транскриптомного анализа установлено, что толерантность к этанолу включает взаимодействие многих генов и затрагивает практически все стороны метаболизма дрожжевых клеток (Ma, Liu, 2010; Stanley et al., 2010; Wolf et al., 2023). Cреди генов, экспрессия которых возрастает при адаптации к этанолу, можно отметить гены, кодирующие белки клеточной оболочки, транспортные белки цитоплазматической мембраны, гены, обеспечивающие функционирование вакуолей, а также гены, продукты которых вовлечены в реакцию на осмотический, тепловой и окислительный стрессы (Ma, Liu, 2010; Stanley et al., 2010; Wolf et al., 2023). Так, показано, что для толерантности дрожжей к этанолу необходимы гены, кодирующие белки теплового шока и факторы транскрипции Msn4p и Msn2p (Ma, Liu, 2010). Отмечается важность длинных некодирующих РНК (Long noncoding RNA, LncRNA), а также белков, участвующих в процессах автофагии (Wolf et al., 2023). Например, фактор транскрипции Rpn4 стимулирует экспрессию системы автофагии при этанольном стрессе посредством активации синтеза вакуолярной протеиназы PRB1 (Bubis et al., 2020). Несмотря на то, что вопросу о механизмах толерантности дрожжей к этанолу посвящено множество работ, в том числе и обзоров (Auesukaree, 2017; Sahana et al., 2024), вопрос о роли фосфорного обмена в адаптации к этанолу у дрожжей не находится в фокусе внимания исследователей. В то же время, фосфорный обмен претерпевает при росте на этаноле значительные изменения. Так, содержание АТФ в клетках Saccharomyces cerevisiae при культивировании на этаноле возрастает на 70% по сравнению с культивированием на глюкозе (Вагабов и соавт., 2011). Неорганические полифосфаты (полиР) являются у многих микроорганизмов одним из факторов адаптации к стрессам (Rao et al., 2009; Denoncourt et al., 2021; Andreeva et al., 2022). При росте S. cerevisiae на этаноле происходят значительные изменения в составе полиР: увеличивается содержание длинноцепочечных фракций и уменьшается содержание короткоцепочечных полимеров (Vagabov et al., 2008), резко снижается содержание полиР в митохондриях (Андреева и соавт., 2008). Такие изменения предполагают возможность вовлечения системы минерального фосфорного обмена в процессы, происходящие в клетках дрожжей при адаптации к этанолу. Среди белков, вовлеченных в гомеостаз фосфора у дрожжей, особый интерес представляют в данном случае транспортеры фосфата, поскольку адаптация к этанолу сопровождается значительными изменениями в цитоплазматической мембране и мембранах других органелл (Ma, Liu, 2010; Stanley et al., 2010).

Цитоплазматическая мембрана клеток дрожжей S. cerevisiae содержит несколько транспортеров фосфата, а вакуолярная мембрана – один транспортер Pho91 с разным сродством к фосфату и регуляторными свойствами (Eskez et al., 2018).

Целью работы было определить влияние нокаут-мутаций в генах, кодирующих переносчики фосфата, на рост и содержание неорганических полифосфатов у S. cerevisiae при культивировании в среде с 4% этанолом.

МАТЕРАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали коммерческие штаммы из коллекции Dharmacon: штамм BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) как родительский штамм (wt) и полученные на его основе штаммы-нокауты по генам, кодирующим переносчики фосфата (табл. 1).

 

Таблица 1. Транспортеры фосфата дрожжей Saccharomyces cerevisiae согласно базе данных SDG (https://www.yeastgenome.org/)

Систематическое обозначение гена (ID)	Название гена	Функции кодируемого белка
YML123С	PHO84	Высокоаффинный транспортер фосфата и низкоаффинный транспортер катионов двухвалентных металлов
YCR037С	PHO87	Низкоаффинный транспортер фосфата плазматической мембраны
YBR296С	PHO89	Na+/Pi симпортер плазматической мембраны
YJL198W	PHO90	Низкоаффинный транспортер фосфата плазматической мембраны
YNR013C	PHO91	Низкоаффинный транспортер фосфата вакуолярной мембраны, экспортирует фосфат из вакуоли в цитоплазму

 

Состав среды и условия культивирования. Культуры поддерживали на агаризованной среде YPD. Инокуляты выращивали на среде YPD (1% дрожжевой экстракт (“Sigma-Aldrich”, США), 2% пептон (“Pronadisa”, Испания) и 2% глюкоза) в колбах Эрленмейера с объемом среды 100 мл при 29°С в течение 24 ч на качалке со 145 об./мин. Для получения кривых роста культуры выращивали на среде YP (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон) с добавлением этанола в концентрациях, указанных в подписях к рисункам и таблицам. Объем среды составлял 50 мл, культивирование проводили при 250 об./мин и 29°С. Оптическую плотность культур измеряли на спектрофотометре (“Unico”, США) при 600 нм в кювете толщиной 3 мм. Для получения биомассы культивирование проводили как на среде YPD с глюкозой, так и на среде YP с 4% этанолом в указанных выше условиях.

Экстракция полифосфатов. Для экстракции полиР использовали образцы биомассы после культивирования на среде с глюкозой в течение 24 ч, а в среде с этанолом – в течение 60 ч. Клетки отделяли от среды центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин и дважды промывали дистиллированной водой при тех же условиях центрифугирования. Образцы по 150 мг сырой биомассы каждый замораживали, хранили при ‒20°С и использовали для анализа. Экстракцию ортофосфата (Pi), кислоторастворимой фракции полиР (полиР1) и кислотонерастворимой фракции полиР (полиР2) проводили при 0°С как описано ранее (Трилисенко и соавт., 2023). Содержание Pi до гидролиза и после гидролиза полифосфатов (Трилисенко и соавт., 2023) определяли колориметрическим методом с малахитовым зеленым (Andreeva et al., 2019) с помощью планшетного фотометра (ОАО “МЗ “Сапфир”, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор концентрации этанола. Мы провели культивирование штамма BY4741 на средах с тремя различными концентрациями этанола (рис. 1). Показано, что уже при культивировании в среде с 4%-ым этанолом происходит увеличение длины лаг-фазы, а при культивировании в среде с 7%-ым этанолом не только увеличивается длина лаг-фазы, но и снижается скорость роста. Таким образом, для выбранного нами штамма дрожжей уже 4% этанола представляют собой стрессовые условия. Для дальнейших исследований мы выбрали эту промежуточную концентрацию.

 

Рис. 1. Рост штамма BY4741 (wt) на средах YP с 1% этанолом (1), 4% этанолом (2) и 7% этанолом (3).

 

Влияние нокаут-мутаций по генам переносчиков фосфата. Мы провели культивирование на этаноле нокаут-мутантов в генах переносчиков фосфата (Eskez et al., 2018), а также в двух генах РНО-пути, PHM6 и PHM7, участвующих в накоплении полиР (Kulakovskaya et al., 2023) в среде с 4% этанолом. Кривые роста штаммов ∆pho84, ∆phm6 и ∆phm7 не отличались от кривых роста родительского штамма BY4741 (не иллюстрируется). Остальные мутантные штаммы демонстрировали либо увеличение продолжительности лаг-фазы, либо уменьшение оптической плотности культуры при выходе на стационарную стадию роста (рис. 2).

 

Рис. 2. Рост штамма BY4741 (wt) и штаммов-нокаут мутантов по генам переносчиков фосфата на среде YP с 4% этанолом: 1 – wt; 2 – Δpho87; 3 – Δpho90; 4 – Δpho91; 5 – Δpho89.

 

Полученные данные свидетельствуют о важном значении систем транспорта фосфата для адаптации к этанолу. Отметим, что при культивировании на глюкозе никакой разницы в характере кривых роста между исследуемыми штаммами найдено не было (не иллюстрируется).

Содержание полифосфатов в клетках мутантов по генам переносчиков фосфата. Для анализа содержания полиР мы выбрали, кроме штамма wt, также мутанты ∆pho87, ∆pho89, ∆pho90 и ∆pho91, поскольку у этих штаммов наблюдали изменения кривых роста. В табл. 2 показано содержание кислоторастворимых полиР1 (относительно короткоцепочечных) и кислотонерастворимых полиР2 (относительно длинноцепочечных) в клетках родительского и мутантных штаммов при культивировании в среде с глюкозой в течение 24 ч или в среде с 4% этанолом в течение 60 ч.

 

Таблица 2. Содержание кислоторастворимых полиР (полиР1) и кислотонерастворимых полиР (полиР2) в клетках родительского и мутантных штаммов S. cerevisiae; мкмоль Р/г сырой биомассы. Культивирование проводили в течение 24 ч на среде YPD с 2% глюкозой и в течение 60 ч на среде YP с 4% этанола. Статистическую значимость оценивали относительно данных для штамма WT с помощью t-критерия Стьюдента, используя стандартную программу Excel: ** ‒ p < 0.01; * ‒ p < 0.1; во всех остальных случаях разница статистически незначима

Штамм	Среда с 2% глюкозой		Среда с 4% этанола
	ПолиР1	ПолиР2	ПолиР1	ПолиР2
WT	48.4 ± 7.2	45.6 ± 7.84	7.73 ± 4.0	53.4 ± 11.6
Δpho87	41.2 ± 9.95	36.3 ± 8.06	12.8 ± 3.85	13.9 ± 2.18 **
Δpho89	51.4 ± 7.01	37.3 ± 0.496	15.9 ± 4.67 *	39.5 ± 7.6
Δpho90	37.9 ± 2.41	38.3 ± 10.3	25.3 ± 4.9 **	36.6 ± 4.72
Δpho91	48.1 ± 1.72	46.7 ± 5.16	32.6 ± 4.8 **	30.1 ± 3.44 *

 

Содержание ортофосфата в клетках всех штаммов при культивировании на глюкозе не имело статистически достоверных различий и составляло 34‒39 и 20‒25 мкмоль Р/г сырой биомассы при росте в средах с глюкозой и этанолом соответственно. При росте на глюкозе некоторые мутантные штаммы имели сниженное содержание полиР, однако это снижение не было значительным (табл. 2). При культивировании на этаноле, с одной стороны, произошли значительные изменения в содержании полиР у штамма wt (табл. 2), а с другой стороны, выявились различия между штаммами. Суммарное содержание полиР снизилось у всех штаммов в неодинаковой степени. Характерным изменением в содержании полиР при росте на этаноле является снижение содержания короткоцепочечных полиР1 и увеличение содержания длинноцепочечных полиР2 (Vagabov et al., 2008). Такое изменение в содержании полиР наблюдали только у штамма wt (табл. 2). У мутантных штаммов содержание полиР2 либо не увеличивалось, либо даже резко уменьшалось, как у штамма Δpho87. Cнижение содержания полиР1 ни у одного из мутантных штаммов не достигало уровня, характерного для штамма wt. По-видимому, нарушение транспорта фосфата через цитоплазматическую и вакуолярную мембрану вызывает изменения в содержании полиР разной длины цепи в условиях спиртового стресса. Кроме того, судя по снижению содержания полиР, эти полимеры с высокой энергией фосфоэфирной связи расходуются клетками на поддержание жизнеспособности на ранних стадиях роста, когда системы защиты от повышенной концентрации этанола еще не сформированы. В наибольшей степени снижено содержание полиР у штамма Δpho87 (табл. 2). Отметим, что среда культивирования содержала свыше 7 мМ фосфата, что не является лимитирующей концентрацией. Мы проверили, как меняется концентрация фосфата к стационарной стадии роста на средах с глюкозой и этанолом для штамма wt и штамма Δpho87, поскольку этот мутант в наибольшей степени утратил свои полиР. Эти изменения позволяют оценить общую способность клеток дрожжей к поглощению фосфата из среды. Оказалось, что при культивировании в среде с глюкозой способность к поглощению фосфата не различалась у этих двух штаммов (рис. 3).

 

Рис. 3. Концентрация фосфата в среде до культивирования (А) и после культивирования штаммов S. cerevisiae в среде YPD c 2% глюкозой (Б) и YP с 4% этанолом (B): 1 – штамм wt; 2 – штамм Δpho87. Статистическую значимость оценивали относительно данных для штамма wt с помощью t-критерия Стьюдента, используя стандартную программу Excel: В – p < 0.01; A и Б – разница статистически незначима.

 

При культивировании в среде с 4% этанолом способность к поглощению фосфата у штамма Δpho87 была снижена по сравнению со штаммом wt (рис. 3). Это объясняет низкий уровень полиР при культивировании мутантного штамма в среде с 4% этанолом. В литературе имеются сведения о сложных путях настройки активности переносчиков фосфата у дрожжей, когда происходит интеграция нескольких механизмов передачи сигналов, чтобы приспособить системы гомеостаза фосфора к общему статусу окружающей среды (Ghillebert et al., 2011; Eskes et al., 2018).

В совокупности наши результаты показывают, что переносчики фосфата Pho87, Pho89, Pho90 и Pho91 вовлечены в адаптационные процессы, позволяющие клеткам дрожжей преодолевать стресс, вызванный повышенной концентрацией этанола.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

Л. А. Ледова

ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук”

Автор, ответственный за переписку.
Email: alla@ibpm.ru

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Россия, 142290, Пущино

Л. П. Рязанова

ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук”

Email: alla@ibpm.ru

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Россия, 142290, Пущино

Т. В. Кулаковская

ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук”

Email: alla@ibpm.ru

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Россия, 142290, Пущино

Список литературы

Дополнительные файлы