Фотосенсибилизирующие свойства производного бета-дикетоната дифторида бора

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Исследована фотосенсибилизирующая способность производного бета-дикетоната дифторида бора. Установлены спектрально-люминесцентные свойства красителя и спектрально-кинетические характеристики его триплетного состояния. Определена квантовая эффективность образования синглетного кислорода. Показана фотосенсибилизирующая активность красителя в отношении опухолевых клеток аденокарциномы толстой кишки in vitro и получены значения темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Благодаря выраженным люминесцентным свойствам бета-дикетонаты дифторида бора привлекают внимание для использования в клеточной визуализации [1–3] создания флуоресцентных проб [4–8]. Красители данного класса могут обладать термохромной [9, 10] и механохромной [11–13] люминесценцией. Данные красители используются для включения в полимерные материалы [14, 15]. Введение тяжелого атома в структуру соединений на основе бета-дикетонатов дифторида бора существенно увеличивает квантовый выход интеркомбинационной конверсии рассматриваемого класса соединений, что позволяет расширить применение за счет фотосенсибилизирующего действия [16, 17].

Данная работа посвящена исследованию фотосенсибилизирущих свойств DBD (2,2-дифторо-4-(4-бромфенил)-6-(4-метоксифенил)-1,3,2-диоксокарборина) в бесклеточных системах и в экспериментах in vitro на культуре опухолевых клеток.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Регистрацию спектров поглощения производили на спектрофотометре Shimadzu UV3101PC (Shimadzu, Япония) в кварцевых кюветах 1 × 1 см. Эксперименты по импульсному фотолизу проводили на установке лазерного фотолиза LKS 80 (Applied Photophysics, Великобритания), с использованием Nd:YAG лазера lвозб = 355 нм, 5 нс). Регистрацию спектров флуоресценции и люминесценции синглетного кислорода проводили с помощью спектрофлуорометра FluoTime 300 (PicoQuant, Германия), с возбуждением ксеноновой лампой (lвозб = 355 нм и lвозб = 410 нм соответственно). В качестве стандарта для измерения квантового выхода флуоресценции использовался антрацен в этаноле Φфл = 0.27 [18]. Использовались растворы испытуемого образца и стандарта со значениями оптической плотности около 0.05 на 1 см в точке возбуждения.

ИК-спектры записывали на приборе «IR Prestige-21» («Shimadzu») в таблетках с KBr. Масс-спектры записывали в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов, источник ионизации ESI, масс-спектрометрический детектор «Shimadzu LCMS-2010EV». Образцы вводили в детектор в системе ацетонитрил—вода (9 : 1). Спектры ЯМР 1Н (400 МГц) и 13С (100 МГц) записаны на спектрометре «Bruker WH 400» с использованием тетраметилсилана в качестве стандарта.

Для экспериментов использована клеточная линия человека HCT116 (аденокарцинома толстой кишки). Она протестирована в American Type Culture Collection, США. Клетки НСТ116 культивировали в среде DMEM. В культуральную среду добавляли следующие компоненты до конечных концентраций: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (среды и добавки производства ПанЭко, Россия), инкубация проводилась при 37°С, 5% СО2 в увлажненной атмосфере. В экспериментах использована культура в логарифмической фазе роста. Для профилактики микоплазменного заражения использовался препарат Mycokill (GE, США). Перед началом экспериментов проводилось не менее трех пассажей на свободной от антимикоплазменного препарата среде.

Цитотоксическое действие исследованного соединения оценивали методом МТТ-теста (по способности восстановления желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола в темно-синий кристаллический формазан митохондриями живых клеток). По результатам исследования цитотоксичности построены кривые выживаемости.

Клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в 190 мкл культуральной среды), инкубировали 24 ч при 37оС, 5% СО2, в увлажненной атмосфере. Вносили по 10 мкл раствора исследуемых веществ в культуральной среде, приготовленных серийными разведениями из исходных растворов, до конечных концентраций 1.6–50 мкмоль/л (конечная концентрация растворителя не превысила 0.5 об. %). Контролем служили клетки без препарата (интактный контроль). В темновом эксперименте клетки инкубировали 48 ч при 37оС, 5% СО2, в увлажненной атмосфере и за 1 ч до окончания инкубации в лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия). В световом эксперименте клетки инкубировали 24 ч при 37оС, 5% СО2 с теми же концентрациями соединения, заменяли клеточную среду, после чего фотовозбуждали накопленное клетками соединение диодным источником света 400 нм (конечная плотность дозы 30 Дж/см2), инкубировали 24 ч в темноте для развития гибели и в лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия). После окончания инкубации клеток с МТТ-реагентом культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Мultiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 571 нм. Процент клеток, выживших при действии каждой концентрации исследуемых веществ, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных лунок (значения последних приняты за 100%). Каждую концентрацию изучали c 3-х кратной статистикой по результатам трех независимых экспериментов.

2,2-Дифтор-4-(4′-бромфенил)-6-(4′-метоксифенил)-1,3,2-диоксаборин (DBD). Порошок желтого цвета, т. пл. 217—219°С. Спектр ЯМР 1Н (aцетон-d6, δ, м.д., J/Гц): 3.96 (с, 3 Н, СН3О); 7.12 (д, 2 Н, C6H4Br, J = 12.0); 7.69 (с, 1 Н, γ-СН); 7.81 (д, 2 Н, C6H4OMe, J = 8.6); 8.31 (д, 2 Н, C6H4Br, J = 8.6); 8.35 (д, 2 Н, C6H4OMe, J = 9.4). Спектр ЯМР 13C (aцетон-d6, δ, м.д.): 57.28, 94.92, 116.61, 131.09, 132.08, 133.85, 134.14, 134.95, 136.34,168.12, 206.85. ИК-спектр (KBr), ν/см–1: 1605, 1589 (BrC6H4, CH3OC6H4); 1555, 1523 (C=O, C=C); 1273 1253 (B—F); 1128, 1094 (B—O). Масс-спектр (ESI+), m/z (Iотн (%)): 417 [M + 2H2O]+ (100), 366 [M–F]+(40). Найдено (%): С, 50.27; Н, 3.41. C16H12BrBF2O3. Вычислено (%): С, 50.89; H, 3.15.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Соединение DBD (2,2-дифторо-4-(4-бромфенил)-6-(4-метоксифенил)-1,3,2-диоксокарборин (рис. 1) был синтезирован раннее [19], однако его фотосенсибилизирующие свойства не были охарактеризованы.

 

Рис. 1. Структурная формула DBD.

 

Спектры поглощения и флуоресценции в ацетонитриле (рис. 2) соединения DBD характеризуются максимумом поглощения 410 и 456 нм соответственно. Квантовый выход флуоресценции DBD в ацетонитриле составил 0.80, что указывает на выраженные люминесцентные характеристики данного красителя.

 

Рис. 2. Нормализованные спектры поглощения и флуоресценции соединения DBD в ацетонитриле.

 

Введение атома брома в молекулу дибензоилметанатдифторида бора приводит к ускорению интеркомбинационной конверсии в результате усиления спин-орбитального взаимодействия. В экспериментах по импульсному фотолизу, при фотовозбуждении раствора соединения DBD в ацетонитриле в присутствии кислорода наблюдается выцветание основного состояния около 400 нм, соответствующего полосе синглет-синглетного поглощения вещества, и поглощение триплетного состояния в более длинноволновой области (450–750 нм) (рис. 3, вставка). Полученная константа скорости гибели триплетного состояния DBD в обескислороженном ацетонитриле составила kT = 2.0 × 104 c-1. С учетом растворимости кислорода в ацетонитриле [20], константа тушения триплетного состояния кислородом составила 1.0 × 109 M-1 с-1.

 

Рис. 3. Дифференциальный спектр поглощения соединения DBD (С = 3.0 × 10-5 М) в ацетонитриле в присутствии кислорода, 100 нс после вспышки (lвозб = 355 нм). Вставка: кинетика гибели триплетного состояния при 700 нм (kT = 2.5 × 106 c-1).

 

В результате переноса энергии с триплетного состояния красителя DBD на молекулярный кислород происходит образование синглетного кислорода (1O2), который является цитотоксическим интермедиатом:

3DBD + 3O2 → 1DBD + 1O2.

Регистрация люминесценции синглетного кислорода проводится в ближнем ИК-диапазоне электромагнитного спектра (lмакс ≈ 1275 нм) (рис. 4).

1O2 → 3O2 + hυ.

 

Рис. 4. Спектр люминесценции синглетного кислорода в растворе DBD (С = 3.5 × 10-6 М) в ацетонитриле (lвозб = 410 нм).

 

Для оценки эффективности процесса переноса энергии проводили определение квантового выхода синглетного кислорода с использованием раствора тетрафенилпорфирина в ацетонитриле в качестве стандарта (ФD = 0.60) [21]. Для соединения DBD в ацетонитриле квантовый выход синглетного кислорода составил 0.13.

Для проверки фотосенсибилизирующих свойств DBD на культивированных клетках in vitro был использован метод определения выживаемости клеток МТТ-тест. Исследована цитотоксическая активность синтезированного соединения на опухолевых клетках карциномы толстой кишки человека НСТ116 в условиях темнового эксперимента и эксперимента с фотовозбуждением красителя (рис. 5).

 

Рис. 5. Кривые выживаемости клеток НСТ116 при действии исследованного соединения: в темноте после 48 ч инкубации и после 24 ч накопления, освещения (400 нм, 30 Дж/см2 и 24 ч инкубации клеток) в эксперименте по фотовозбуждению.

 

В течение 48 ч инкубации в темноте цитотоксичность исследованного соединения была незначительна — показатель IC50 составил 23 ± 2.2 мкМ. В световом эксперименте после накопления соединения 24 ч и фотовозбуждения диодным источником на 400 нм, 30 Дж/см2 с последующей инкубацией клеток 24 ч произошло усиление гибели клеток – фотоиндуцированный показатель цитотоксичности IC50 составил 6.0 ± 0.5 мкМ. Так, исследованное соединение проявляет свойства фотосенсибилизатора, вызывая дозозависимую гибель опухолевых клеток НСТ116 в субмикромолярном диапазоне концентраций после фотовозбуждения большую, чем при инкубации в темноте.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованы фотохимические свойства производного бета-дикетоната дифторида бора. В результате фотовозбуждения молекул DBD установлено образование триплетного состояния красителя. Определена квантовая эффективность образования синглетного кислорода в растворе DBD. В клеточных экспериментах соединение DBD проявляет свойства фотосенсибилизатора, вызывая дозозависимую гибель опухолевых клеток НСТ116 в субмикромолярном диапазоне концентраций за счет образования активных форм кислорода.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-23-00461. Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП “Новые материалы и технологии” ИБХФ РАН. Эксперименты на клетках проводились на базе ЦКП “Новые материалы и технологии” Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН при поддержке Государственной программы Российской Федерации для Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН (проект № 122041400114-2).

×

Об авторах

А. Е. Егоров

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334

А. Г. Мирочник

Институт химии ДВО РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, проспект 100-летия Владивостока 159, Владивосток, 690022

Е. В. Федоренко

Институт химии ДВО РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, проспект 100-летия Владивостока 159, Владивосток, 690022

Н. А. Любых

Институт химии ДВО РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, проспект 100-летия Владивостока 159, Владивосток, 690022

А. A. Костюков

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334

А. А. Маркова

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334

И. Д. Бурцев

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334

М. Т. Нгуен

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334

В. И. Погонин

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН; Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334; ул. Косыгина, 19, Москва, 119334

Е. А. Зевакин

Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 19, Москва, 119334

В. А. Кузьмин

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: ae.yegorov@gmail.com
Россия, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334

Список литературы

  1. Zhang J., Chen Q., Fan Y., Qiu H., Ni Z., Li Y., Yin S. // Dye. Pigment. 2021. V. 193. P. 109500.
  2. Mirochnik A.G., Puzyrkov Z.N., Fedorenko E. V., Svistunova I. V., Markova A.A., Shibaeva A.V., Burtsev I.D., Kostyukov A.A., Egorov A.E., Kuzmin V.A. // Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2023. V. 291. P. 122319.
  3. Kerr C., DeRosa C.A., Daly M.L., Zhang H., Palmer G.M., Fraser C.L. // Biomacromolecules. 2017. V. 18. P. 551–561.
  4. Shen Z., Gao Y., Li M.; Zhang Y., Xu K., Gong S., Wang Z., Wang S. // Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2022. V. 281. P. 121609.
  5. Park K., Kim M.K., Seo Y., Ha T., Yoo K., Hyeon S.J., Hwang Y.J., Lee J., Ryu H., Choo Н.А. // ACS Chem. Neurosci. 2017. V. 8. pp. 2124–2131.
  6. DeRosa C.A., Kolpaczynska M., Kerr C., Daly M.L., Morris W.A., Fraser C.L. // Chempluschem. 2017. V. 82. pp. 399–406.
  7. Ma Q., Zhang Y., Jiao Y., Zhang T., Chu Q., Xiao H., Zhou Z., Liu Y. // Analyst. 2021. V. 146. P. 5873–5879.
  8. Liu X., Sun H., Shu W., Zhai Z., Xiao H., Zhang T., Liu Y. // ChemistrySelect. 2022. V. 7. P. e202202272.
  9. Wang J.-X., Yu Y.-S., Niu L.-Y., Zou B., Wang K., Yang Q.Z. // Chem. Commun. 2020. V. 56. pp. 6269–6272.
  10. Jimenez R., Duarte F., Nuti S., Campo J.A., Lodeiro C., Cano M., Cuerva C. // Dye. Pigment. 2020. V. 177. P. 108272.
  11. Poggi B., Lopez E., Métivier R., Bodelot L., Allain C. // Macromol. Rapid Commun. 2022. V. 43. P. 2200134.
  12. Mehiaoui N., Leleu S., Kibou Z., Choukchou-Braham N., Franck X., Gallavardin T. // Dye. Pigment. 2022. V. 208. pp. 110829.
  13. Butler T., Zhuang M., Fraser C.L. // J. Phys. Chem. C 2018. V. 122. P. 19090–19099.
  14. Gong W., Dong K., Liu L., Hassan M., Ning G. // Catal. Sci. Technol. 2021. V. 11. pp. 3905–3913.
  15. Mirochnik A.G., Fedorenko E.V., Shlyk D.K. // Russ. Chem. Bull. 2016. V. 65. pp. 806–810.
  16. Li J., Wang X., Pan Y., Sun Y., Wang G., Zhang K. // Chem. Commun. 2021. V. 57. pp. 8794–8797.
  17. Samonina-Kosicka J., DeRosa C.A., Morris W.A., Fan Z., Fraser C.L. // Macromolecules. 2014. V. 47. pp. 3736–3746.
  18. Demasa J.N., Crosby G.A. // J. Chem. Phys. 1968. V. 48. P. 4726.
  19. Gukhman E. V., Reutov V. A. // Russ. J. Gen. Chem. 1999. V. 69. P. 1608.
  20. Franco C., Olmsted III, J. // Talanta. 1990. V. 37. pp. 905–909.
  21. Reinhard S., Ebrahim A. // J. Phys. Chem. 1990. V. 94. pp. 4377–4378.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Структурная формула DBD.

Скачать (61KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Нормализованные спектры поглощения и флуоресценции соединения DBD в ацетонитриле.

Скачать (166KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Дифференциальный спектр поглощения соединения DBD (С = 3.0 × 105 М) в ацетонитриле в присутствии кислорода, 100 нс после вспышки (возб = 355 нм). Вставка: кинетика гибели триплетного состояния при 700 нм (kT = 2.5 × 106 c1).

Скачать (123KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Спектр люминесценции синглетного кислорода в растворе DBD (С = 3.5 × 106 М) в ацетонитриле (возб = 410 нм).

Скачать (114KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Кривые выживаемости клеток НСТ116 при действии исследованного соединения: в темноте после 48 ч инкубации и после 24 ч накопления, освещения (400 нм, 30 Дж/см2 и 24 ч инкубации клеток) в эксперименте по фотовозбуждению.

Скачать (154KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».