Анализ изменчивости генома escherichia coli при воздействии ионизирующего излучения

Полный текст

Ионизирующее излучение, как стресс-фактор физической природы, способно воздействовать на живые клетки прямым (прямое энергетическое действие) и косвенным образом (через образование свободных радикалов) [1–6]. Результатом физико-химического взаимодействия между ионизирующим излучением и ДНК являются одно- и двунитевые разрывы, апуриновые и апиримидиновые сайты, модификации оснований, сшивки ДНК и белков [7, 8].

Степень радиочувствительности биологических объектов можно оценивать, используя различные критерии [9–11]. Критерий выживаемости является основным, при котором характеристикой радиочувствительности служит величина летальной дозы. Принцип действия радиации на биологические объекты объясняется взаимодействием излучения различных видов и энергии с молекулярными структурами, способным привести к повреждениям, способствующим либо возникновению изменений функций процессов, происходящих внутри клетки, либо гибели организма.

Радиочувствительность живых организмов в большей степени зависит от размера генома [12, 13], от эффективной работы систем репарации повреждений нуклеиновых кислот и от размера мишени [14, 15], что свидетельствует о том, что более крупные геномы обычно характеризуются сниженной устойчивостью к действию ионизирующей радиации: увеличение размера генома в 10 раз примерно двукратно снижает радиоустойчивость организма. Но основную роль играет не только изначальная радиочувствительность организма, также большое значение оказывает интегральный функциональный резерв, благодаря которому существует возможность быстро и эффективно восстановить клеточные системы после действия излучения. Микроорганизмы обладают значительной устойчивостью к действию ионизирующего излучения [16, 17]. Данное явление основано на высокой степени эффективности системы репарации и реверсии биоповреждений, приобретенной в процессе эволюции в среде обитания с агрессивными факторами (наличие токсических веществ, экстремальные температуры, резкие смены pH, разного рода излучения и т.д.) [18].

Генотипическая изменчивость формируется по причине генетических рекомбинаций и мутаций [19–21]. В ходе эксперимента в качестве мутагена было выбрано направленное влияние гамма-лучей ⁶⁰Co, что позволило нам получить радиоустойчивую Escherichia coli ПЛ-6 (R), отличающуюся от E. coli ПЛ-6 по фенотипическим признакам (морфологические, биохимические, культуральные) и имеющую изменения в геноме по сравнению с контрольной E. coli ПЛ-6 [22–24].

Цель исследования – сравнение и анализ изменчивости генетического материала производственного штамма Escherichia coli ПЛ-6 (в виде контрольного варианта без каких-либо воздействий) и радиомодифицированного варианта E. coli ПЛ-6 (R) (пятый пересев после облучения).

Материалы и методы

В процессе проведения эксперимента использовался производственный штамм Escherichia coli (штамм ПЛ-6, № 1154115 эшерихиозной диареи поросят), полученный из коллекции музея штаммов ФГБНУ ФЦТРБ-ВНИВИ.

Путем облучения E. coli ПЛ-6 последовательно увеличивающимися дозами ионизирующего излучения получен радиорезистентный вариант E. coli ПЛ-6 (R), отличающийся от исходного морфологическими (удлинение клеток до 5 раз) и биохимическими (высокая каталазная, пероксидазная и супероксиддисмутазная активности, способность синтеза цистеина и увеличение содержания ДНК) свойствами, обладающий повышенной степенью устойчивости к действию ионизирующей радиации. С целью получения радиорезистентного E. coli ПЛ-6 (R) микробные клетки облучали на гамма-установке “Исследователь”, изготовленной на заводе “Балтиец” (г. Нарва), ведомственная принадлежность гамма-установки “Исследователь” – Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, с мощностью экспозиционной дозы 3.11 кГр/ч в диапазоне доз от 2 до 30 кГр.

Для получения продуктов метаболизма E. coli ПЛ-6, микроорганизм культивировали на жидких питательных средах (в мясопептонном бульоне) в соответствии с общепринятой в микробиологической практике методикой, получая по три фракции. При этом плотность культур в стационарной фазе роста (24 ч) составляла 2.06 × 10⁹ микробных клеток на 1 мл (E. coli ПЛ-6), содержание сухого вещества в культуральной жидкости – 69.5 ± 1.7 мг/мл.

Клетки микроорганизмов отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 5000 g. Супернатант культуральной жидкости собирали для определения содержания биологически активных веществ. Биомассу суспендировали в дистиллированной воде, после чего вновь центрифугировали в течение 13 мин при 5000 g для отмывания компонентов культуральной жидкости (КЖ).

По данной методике получен очищенный и достаточно плотный осадок микробной биомассы влажностью от 80 до 90%. Биомассу охлаждали до 0ºС и далее разрушали ультразвуковой обработкой (22 кГц) в течение 25 мин, после чего отделяли разрушившиеся клетки и фрагменты клеток центрифугированием в течение 15 мин при 1000 g. Полноту разрушения клеток контролировали микроскопическим методом. В полученном супернатанте определяли содержание антиоксидантного фермента пероксидазы.

Активность супероксиддисмутазы определяли по методу Fridovich (1995). В качестве окислительных субстратов использовали нитросиний тетразолий (НСТ) и N-метилфенозоний метилсульфат. За единицу активности принимали 50%-ное торможение реакции восстановления НСТ.

Выделение нуклеиновых кислот проводилось из взвеси бактерий, полученной путем смыва бактериальных клеток стерильным физиологическим раствором с поверхности плотной питательной среды, с использованием набора “РИБО-преп” согласно инструкции. Применение данного набора подразумевает выделение ДНК и РНК, последняя при этом (без реакции обратной транскрипции) на амплификацию генетического материала E. coli ПЛ-6 влияния не оказывает.

Исследовали метаболизм цистеина у E. coli ПЛ-6. Для этой цели пробы сухой биомассы исходного E. coli ПЛ-6 и радиорезистентного варианта E. coli ПЛ-6-R тест-микроба навеской 100 мг (3.18 × 10¹¹ м. к./мл) подвергали кислотному гидролизу (6 н раствор HCl 1 : 200) при 105ºС в течение 24 ч с последующим хроматографированием определяемой аминокислоты на специальной бумаге (№ 2, сорт 1, “быстрая”, 1992) отечественного производства в соответствии с методическими рекомендациями Т.Н. Зайцевой и Н.Г. Ткачевой (1958). Испытуемые гидролизаты исходного и радиорезистентного вариантов E. coli наносили на бумагу пипеткой на одно и то же место. Таким же способом наносили раствор смеси аминокислот. Разгонку проводили трехкратно по 6 ч. Расчеты по определению содержания аминокислот проводили по калибровочным кривым для аминокислот по L-аминному азоту.

Для поиска генов E. coli была использована база генов NCBI. Были выбраны 11 различных локусов, имеющихся у большого разнообразия штаммов и изолятов кишечной палочки размером амплифицируемого фрагмента 2–5 тыс. п. н. (пар нуклеотидов).

Подбор праймеров был выполнен с помощью программы Vector NTI 9.1. Для подбора праймеров критерием служила одинаковая температура отжига, обеспечивающая амплификацию всех праймеров по одной программе. Используемые в исследовании праймеры указаны в табл. 1.

 

Таблица 1. Праймеры, используемые в работе

Название локуса	Нуклеотидная последовательность прямого праймера	Нуклеотидная последовательность обратного праймера	GenBank ID
1pO26-Vir	aactcttcctgttctgattcttctgg	gctattcataactttattccacgatttaac	NC_012487
1pVM01	aactccctcgtcacagcactga	ccctctttacgcttctgctgc	EU330199
1p417H-90	ctcaccctgtctgttgttgctgt	gcagttcagaatactgtcctcttacaata	JQ418522
1pNDM102337	tggagaacacaatgcgaagtca	cctttcctgagcattcttccg	NC_019045
1pChi7122-2	ccctgtctgttgttgctgtgg	gcattctttcctgacccgattt	NC_019037
3pO26-Vir	atcagcatttaatacagcatcatcaag	ttgtcgttaaagttgttgagtgtgtg	NC_012487
2pNDM102337	gggatttcgagaagatggtcagtat	tagaacctttgatttgctatgttgtacc	NC_019045
1pChi7122-3	aatggtcgcaaagcagaacg	ttagtgcatgtcctgtgaatcgtc	FR851304
4pO26-Vir	tactctcttaaatacagccatattacaggag	ggaaattagcgttgactgcattatc	NC_012487
1pO86A1	cgtcgggttattcttacatctgttg	cagtcccaaacgcatattatcctt	AB255435
4pVM01	atcagttatttcgtgattttgctgaa	ccgtcagatcgaactcataatgc	EU330199

 

Амплификация выделенной ДНК была проведена при следующих условиях:

– объем реакционной смеси составлял 15 мкл, из них: H₂O – 4.0, буфер + EvaG – 1.5, MgCl₂ 5 млМ – 1.5, dNTP 2.5 мМ – 1.5, праймер F 10 пкМ – 0.5. праймер R 10 пкМ – 0.5, Tag-полимераза 2.5 ед – 0.5, ДНК – 5 (общие компоненты реакционной смеси произведены компанией ЗАО “Синтол”, Россия);

– температурный режим: горячий старт 950С – 300 с, 45 циклов – 950С – 15 с, 48–580С – 30 с (детектирование продуктов амплификации), 720С – 10 с.

Электрофоретическая детекция продуктов амплификации была осуществлена в 1.7%-ном агарозном геле при напряжении постоянного тока 100 В в течение 50 мин. Окрашивание фрагментов ДНК проводили бромистым этидием.

Применение разработанных праймеров выявило возможность амплификации единичного генетического маркера и множественную ПЦР. Последняя позволяет проводить индикацию изменчивости генома облученных клеток E. coli без дополнительной стадии рестрикции наработанного генетического материала. Величину амплифицированных фрагментов ДНК определяли в сравнении с маркером молекулярной массы ДНК (молекулярная масса фрагментов ДНК шагом 100 п. н.) при электрофорезе. Анализ молекулярной массы амплифицированных фрагментов ДНК проводили в программе GelAnalyzer 19.1 (OpeneBench, Испания). В результате было выявлено, что действие лучей ⁶⁰Co вызвало повреждения в структуре ДНК. Для определения изменчивости генетического материала эшерихий был выполнен ряд пересевов облученной культуры, что способствовало восстановлению структуры ДНК исследуемых бактериальных клеток. При амплификации анализируемых локусов в условиях синтеза нескольких фрагментов в одной реакционной смеси (один маркер) установлено различие в генетическом составе у облученных и необлученных клеток E. coli. Такая возможность выявления генетических различий в нуклеотидном составе бактерий до и после облучения определена у 11 амплифицируемых локусов.

Результаты

Изучение активности ферментов антиоксидантной защиты микроорганизма выявило, что как исходная, так и облученные Esсherichia coli ПЛ-6 имеют определенную ферментативную активность: в первые 24 ч после посева бактерии разлагают лактозу, глюкозу, сахарозу и маннит, образуя при этом кислоту и газ, не образуют сероводород, не разжижают желатин и не синтезируют цитраты. При культивировании на 5%-ном мясопептонном кровяном агаре было выявлено, что вокруг микробных колоний в процессе роста появлялись зоны просветления, что свидетельствует о способности культуры выделять фермент β-гемолизин.

Для анализа биохимической активности были определены продукты обмена веществ, обладающие, по данным литературы [25], свойством формирования устойчивости организма при лучевом поражении, такие как группа антиокислительных ферментов (каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза), цистеин и ДНК. Биохимическая активность была определена у контрольного и подвергшегося воздействию гамма-лучей ⁶⁰Co варианта E. coli ПЛ-6 (культура, облученная в дозе 30 кГр). Полученные результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Содержание ДНК, цистеина, каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (СОД) в культуральной жидкости E. coli ПЛ-6 и ее радиомодифицированного варианта

Показатель	Единица измерения	Контрольная культура E. coli ПЛ-6	Радиомодифицированная культура E. coli ПЛ-6 (R)
Каталаза	мкат/мл	856.0 ± 12.3	3951.0 ± 21.5*
СОД	мг/белка	483.2± 0.32*	1.55 ± 0.27*
Пероксидаза	мкМ/г	0.705 ± 0.03	3.719 ± 0.85*
Цистеин	мкг/мл	1.173 ± 0.03	2.395 ± 0.01*
ДНК	мкг/109мл	0.302 ± 0.05	7.45 ± 0.29*

Примечание. * – p ≤ 0.05.

 

Результаты биохимических исследований показали, что приобретенное в результате воздействия гамма-лучей на E. coli в возрастающих дозах изменение стимулирует у тест-микроба развитие радиорезистентности с изменением клеточного метаболизма, что сопровождается усилением синтеза нуклеиновых кислот (ДНК) и ферментов антиоксидантной защиты, а именно каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы, а также усилением синтеза серосодержащей аминокислоты цистеина из ее предшественников – серина и глицина.

Таким образом, в результате радиомикробиологических исследований получен радиорезистентный (радиомодифицированный) вариант E. coli (R), отличающийся от исходного штамма E. coli ПЛ-6 биохимическими характеристиками (увеличение синтеза ДНК, усиленная активизация ключевых ферментов антирадикальной защиты: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, а также серосодержащей аминокислоты цистеин обладающих радиопротекторными свойствами).

Усиление синтеза нуклеиновых кислот под воздействием гамма-лучей, как видно из вышеприведенных данных, может свидетельствовать о том, что повышение радиорезистентности тест-штамма E. coli в процессе радиомутации может осуществляться за счет изменения синтеза тиоловых (сульфгидрильных) групп белков, особенно важнейшей аминокислоты цистеина, синтез и взаимопревращение которого находится под контролем генетического аппарата клеток – РНК, ДНК. Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что в процессе роста на питательной среде исследуемый микроорганизм выделяет ценные метаболиты. При облучении культуры последовательно возрастающими дозами гамма-квантов повышается ее устойчивость, при которой происходит изменение метаболизма бактериальных клеток, что приводит к увеличению синтеза антиоксидантных ферментов.

Для изучения возможных изменений генома предварительно перед амплификацией ДНК проводили контрольный электрофорез для выявления фрагментов ДНК с низкой молекулярной массой (100–5000 п. н.). Контрольный образец характеризовался отсутствием визуально видимых фрагментов ДНК различной молекулярной массы. Результат электрофореза радиомодифицированного восстановленного образца был идентичен контрольному образцу.

Разработанные праймерные комбинации подвергали амплификации в различных температурных режимах отжига олигонуклеотидных затравок. В результате чего установлено, что во время амплификации при температуре отжига индивидуальной для каждой комбинации праймеров образуется множество продуктов ПЦР. Данное обстоятельство позволило произвести анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов. Результат электрофоретического разделения продуктов амплификации в режиме температурного градиента представлен в табл. 3. Исходя из результатов электрофореза были подобраны режимы, характеризующиеся накоплением множества ярких и дискретных полос, позволяющих провести анализ генетических различий (в случае наличия таковых) у облученных и необлученных микробных культур.

 

Таблица 3. Количество продуктов амплификации при различных температурных режимах отжига праймеров с ДНК необлученной бактериальной культуры

Название локуса	Температура отжига					GenBank ID
	48°С	50°С	54°С	57°С	58°С
1pO26-Vir	–	9*	3	–	–	NC_012487
1pVM01	10*	5	–	1	–	EU330199
1p417H-90	3	3*	–	–	–	JQ418522
1pNDM102337	1	2	–	3*	–	NC_019045
1pChi7122-2	3	3	3	8*	–	NC_019037
3pO26-Vir	2	2*	–	–	1	NC_012487
2pNDM102337	–	3*	–	–	–	NC_019045
1pChi7122-3	–	1	1	4*	–	FR851304
4pO26-Vir	–	1*	–	–	–	NC_012487
1pO86A1	–	–	–	3*	–	AB255435
4pVM01	–	3*	–	–	–	EU330199

Примечание. * – температура отжига праймеров, используемая в дальнейшей работе.

 

Амплификация облученной и исходной ДНК характеризовалась формированием паттернов, молекулярная масса которых в обеих пробах имела значительные различия. Такая картина была установлена во всех 11 амплифицируемых локусах. На представленных рис. 1, 2 четко видны различия молекулярных масс ампликонов контрольных и облученных эшерихий. Для выявления количества амплифицированных фрагментов и их размеров был проведен анализ результатов электрофореза в программе GelAnalyzer 19.1. Числовые данные представлены в табл. 4. Исходя из показателей количества и размера амплифицированных продуктов с применением каждого из представленных праймерных комбинаций у кишечной палочки до и после гамма-облучения установлено значительное изменение генома.

 

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации локусов 1pO26-Vir, 1pVM01, 1p417H-90, 1pNDM102337, 1pChi7122-2 и 3pO26-Vir. М – маркер молекулярной массы ДНК “М16” (Сибэнзим, Россия); 1, 2 – локус 1pO26-Vir; 3, 4 – локус 1pVM01; 5, 6 – локус 1p417H-90; 7, 8 – локус 1pNDM102337; 9, 10 – локус 1pChi7122-2, 11, 12 – локус 3pO26-Vir; контрольные образцы – 1, 3, 5, 7, 9 и 11; облученные образцы – 2, 4, 6, 8, 10 и 12.

 

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации локусов 2pNDM102337, 1pChi7122-3, 4pO26-Vir, 1pO86A1, 4pVM01. М – маркер молекулярной массы ДНК “М16” (Сибэнзим, Россия); 1, 2 – локус 2pNDM102337; 3, 4 – локус 1pChi7122-3; 5, 6 – локус 4pO26-Vir; 7, 8 – локус 1pO86A1; 9, 10 – локус 4pVM01; контрольные образцы – 1, 3, 5, 7 и 9; облученные образцы – 2, 4, 6, 8 и 10.

 

Таблица 4. Молекулярные массы ампликонов

Название локуса	Культура E. coli до облучения	Культура E. coli после облучения
1pO26-Vir	1836, 1586, 1312, 1121, 991, 807, 736, 298, 228	1014, 845, 316
1pVM01	2079, 1759, 1594, 1356, 1205, 938, 879, 661, 570, 462	1736, 1605, 1090, 983, 884, 675, 579, 224
1p417H-90	1638, 557, 204	1992, 1292, 972, 784, 660, 476, 408, 252, 207
1pNDM102337	1261, 878, 237	1776, 1140, 929, 536, 435, 302, 239, 150
1pChi7122-2	1763, 1021, 942, 768, 690, 651, 482, 270	1366, 1056, 680, 544, 481, 398, 372
3pO26-Vir	997, 517	963, 832, 665, 378, 305
2pNDM102337	1013, 930, 293	1043, 735, 583
1pChi7122-3	1817, 1102, 931, 227	1627, 1099, 482
4pO26-Vir	1122	1817, 1550, 650, 481
1pO86A1	1053, 809, 349	1380, 1262, 790, 472
4pVM01	1224, 827, 523	1740, 1334, 983, 933, 896, 253

 

Обсуждение

В результате радиомикробиологических исследований получен радиорезистентный (радиомодифицированный) вариант E. coli ПЛ-6 (R), отличающийся от исходного штамма E. coli ПЛ-6 биохимическими свойствами, усилением синтеза нуклеиновых кислот (ДНК) и ферментов антиоксидантной защиты, а именно каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы, а также усилением синтеза серосодержащей аминокислоты цистеин из ее предшественников – серина и глицина.

Перестройка генома E. coli ПЛ-6 (R) после восстановления повреждений, полученных в результате воздействия гамма-лучей ⁶⁰Co, заключалась в изменениях сайтов гибридизации праймеров и рекомбинации внутри амплифицируемых фрагментов ДНК.

Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства КФУ (Приоритет 2030).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

М. Ю. Галлямова

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

Автор, ответственный за переписку.
Email: kostya9938@yandex.ru
Россия, Казань

К. Н. Вагин

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности; Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: kostya9938@yandex.ru
Россия, Казань; Казань

Н. М. Василевский

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

Email: kostya9938@yandex.ru
Россия, Казань

Н. И. Хаммадов

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

Email: kostya9938@yandex.ru
Россия, Казань

Список литературы

Дополнительные файлы