Differentiation of Juniperus deltoidеs R.P. Аdams in the Crimean-Caucasian Region According to the Variability of Microsatellite DNA Markers

Толық мәтін

Важным компонентом средиземноморских аридных и полуаридных экосистем является теплолюбивый и исключительно засухоустойчивый вид можжевельник колючий или красный ‒ Juniperus oxycedrus L. (семейство Cupressaceae). Это небольшое деревце или кустарник с красновато-коричневыми шишкоягодами и колючей хвоей. Внутри этого изменчивого вида выделяют четыре подвида, различающихся по габитусу, размеру шишкоягод и ширине хвои [1]. Из них наиболее распространенным является J. oxycedrus subsp. oxycedrus, который свою очередь также оказался неоднороден. Применение молекулярных методов и анализ содержания терпеноидов в листьях выявили существенные различия между западно- и восточно-средиземноморскими особями, что послужило причиной выделения двух отдельных видов – типичного J. oxycedrus в западном Средиземноморье и нового вида J. deltoides R.P. Аdams в Восточно-Средиземноморском регионе (Балканы, Малая Азия, Крым) [2–4] (рис. 1). Внешние отличия J. deltoides незначительны и сводятся к линейно-треугольным листьям и наличию на шишкоягоде выступающих кончиков семенных чешуй (у J. oxycedrus узколанцетные листья и незаметные рубчики на шишкоягоде). Отсутствие явных морфологических различий между этими двумя таксонами позволило рассматривать J. deltoides как криптовид [3]. Предполагают, что так же, как у многих других древесных видов, эта дифференциации связана с расселением из разных рефугиумов в плейстоцене – восточных популяций из восточно-средиземноморских плейстоценовых рефугиумов в Малой Азии и на Аравийском полуострове, а западных – из западно-средиземноморских рефугиумов в южной части Пиренейского полуострова и Северо-Западной Африки [6, 7].

 

Рис. 1. Ареалы Juniperus deltoides (красный цвет) и J. oxycedrus (синий цвет) по R.P. Adams [3].

 

Можжевельник колючий, произрастающий в районе наших исследований (Крымский п-ов, Краснодарский край и Болгария), находится в восточной части обширного ареала и, согласно вышеупомянутым исследованиям, относится к J. deltoides. Хотя существуют мнения, что отличия этого криптовида отражают скорее внутривидовую изменчивость [1, 8], мы в данной работе будем использовать номенклатурное название J. deltoides.

Использование ядерных микросателлитов (SSR-маркеров) для этого видового комплекса позволило выявить дальнейшую дифференциацию J. deltoidеs на балканскую и азиатскую группы [9]. В азиатской группе оказался и J. deltoidеs, собранный на Крымском п-ове. Однако материал исследования с полуострова был ограничен всего одной популяцией и не позволил сделать конкретные выводы, помимо общих предположений об ограниченном потоке генов, вызванным фрагментацией ареала и/или выживанием в разных рефугиумах во время последних ледниковых циклов.

В целом, следует признать, что исследования биогеографических закономерностей у J. deltoidеs почти не охватывают крымско-кавказский регион, где проходит северо-восточная граница ареала этого вида. Этот вид растет здесь в горах на небольших высотах и не образует сомкнутых лесов, в отличие от другого распространенного древовидного можжевельника J. exelsa M. Bieb. Ареал J. deltoides в данном регионе в течение прошлого века значительно сократился в результате антропогенного воздействия и подвергся фрагментации. Этот вид включен в Красные Книги Республики Крым и Краснодарского края [10, 11]. Крымский п-ов с точки зрения филогеографии заслуживает особого изучения. Этот уникальный полуостров, который почти полностью окружен Черным и Азовским морями, принято считать самым удаленным северо-восточным эксклавом природы Средиземноморья [12]. Можно предположить, что J. deltoidеs из изолированных популяций Крыма может иметь некоторые генетические отличия от J. deltoidеs, обитающих в других районах Причерноморья (Болгария, Грузия и Анатолийское побережье Турции).

Основной целью данного исследования является оценка генетической изменчивости и популяционной структуры J. deltoides в районе бассейна Черного моря, а также определение существующих биогеографических тенденций и генетических связей между популяциями по данным изменчивости пяти микросателлитных локусов. Полученные результаты и выводы обеспечат теоретическую основу для разработки стратегии сохранения этого вида можжевельника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мультилокусный генетический анализ с помощью ядерных микросателлитов был проведен на 117 образцах ДНК из шести природных популяций можжевельника колючего (две популяции из Краснодарского края, три из Крыма и одна из Болгарии) (табл. 1, рис. 2,а).

 

Таблица 1. Исследуемые популяции Juniperus deltoidеs и параметры генетического разнообразия

№	Популяция	Координаты, с. ш./в. д.	Высота над уровнем моря, м	N	Ne	Ho	He	F
Краснодарский край
1	Большой Утриш	N 44°45´/E 37°23´	125	24	2.58	0.379	0.582	0.318
2	Сукко	N 44°48´/E 37°26´	39	22	2.70	0.382	0.602	0.362
среднее					2.64	0.381	0.592
Крымский полуостров
3	Чуфут-Кале	N 44°44´/E 33°55´	457	23	2.67	0.308	0.570	0.457
4	Бахчисарай	N 44°45´/E 33°54´	332	19	2.32	0.260	0.468	0.426
5	Мыс Мартьян	N 44°30´/E 34°14´	130	19	2.04	0.258	0.428	0.323
cреднее					2.33	0.275	0.489
Болгария
6	г. Пловдив, д. Марково	N 42°02´/E 24°42´	607	10	2.27	0.431	0.509	0.137

Примечание. N – общее количество образцов, Nе – эффективное число аллелей на локус, Hо – наблюдаемая гетерозиготность, Hе – ожидаемая гетерозиготность, F – индекс фиксации.

 

Рис. 2. Очертания района исследований с расположением исследованных популяций J. deltoides, распределение генетических групп и графики с оценками SSR-полиморфизма. Номера популяций и географические координаты пояснены в табл. 1. а – распределение генетических групп J. deltoidеs на основе полиморфизма SSR-маркеров. Цвет значков соответствует группам SAMOVA и PCoA. б –ординация популяций J. deltoides методом главных координат (PCoA) на основе их генетических дистанций; римскими цифрами обозначены группы согласно SAMOVA. в – UPGMA-дендрограмма популяций J. deltoides, построенная на основе их генетических дистанций в программе NTSYSpc 2.1. г – результаты анализа STRUCTURE.

 

ДНК выделяли методом Devey [13] из сухой хвои, засушенной в силикагеле. На четырех образцах ДНК J. deltoides были протестированы 28 пар праймеров: 6 пар, разработанных для J. communis L., [14], 9 пар, разработанных для J. przewalskii Ком. [15], 13 пар – для J. cedrus Webb & Berthel. [16]. Успешно аплифицированные локусы использовали для дальнейшего тестирования. Для этого на восьми образцах ДНК J. deltoides из двух популяций из разных географических точек проводили амплификацию с немечеными олигонуклеотидами, затем визуализировали продукты реакции на акриламидных гелях с серебряным окрашиванием и смотрели, есть ли изменчивость. Локусы, разработанные для J. przewalskii, у J. deltoides оказались неизменчивыми. Из локусов, разработанных для J. communis, были отобраны Jc16, Jc31, Jc32 и Jс35, как нормально амплифицируемые и изменчивые, но в дальнейшем они были исключены из анализа из-за трудностей с интерпретацией. Пять локусов, разработанных для J. cedrus (Jce01, Jce08, Jce10, Jce11 и Jce13), оказались изменчивыми и для J. deltoides и из них был составлен мультиплекс с учетом температуры отжига праймеров, сочетания флуоресцентного красителя и длины продукта (табл. 2). Использовалась следующая программа ПЦР: 5 мин при 95°C, затем 35 циклов: 30 с при 95°C, 45 с при 60°C, 90 с при 72°C и 15 мин при 72°C. ПЦР-продукт разводили в пять раз. 1 мкл разбавленного ПЦР-продукта смешивали с 8.5 мкл формамида и 0.5 мкл размерного стандарта или маркера молекулярной массы S-450 (Гордиз). Длины амплифицированных фрагментов определяли на НАНОФОР-05. Хроматограммы расшифровывались в программе GeneMapper v. 4.0 сначала автоматически, а затем проверялись вручную.

 

Таблица 2. Характеристика пяти микросателлитных локусов, используемых для Juniperus deltoides

Локус	Мотив	Температура отжига, °C	Размер фрагмента, п. н.	Число аллелей
Jce01 F: FAM	(AAACCT)6	60	233–251	4
Jce08 F: FAM	(ATАC)10	60	161–201	8
Jce10 F: FAM	(ATC)10	60	272–293	6
Jce11 F: HEX	(TTC)10	60	327–346	6
Jce13 F: TAMRA	(CATA)12	60	194–222	7

 

С помощью программ GENALEX v. 6.5 [17] и ARLEQUIN v. 3.5.2 [18] вычисляли следующие параметры генетической изменчивости: эффективное число аллелей на локус (Nе), число уникальных аллелей, наблюдаемая (Ho) и ожидаемая (He) гетерозиготности, индекс фиксации (F), коэффициент генетической дифференциации популяций (F_ST). Тест на равновесие Харди‒Вайнберга (HWE) был выполнен с помощью GENEPOP v. 4.2 [19]. Частоту нулевых аллелей оценивали методом Брукфилда [20], реализованным в программном обеспечении MICRO-CHECKER 2.2.3 [21].

Несколько подходов были использованы для изучения популяционной структуры и филогенетических анализов J. deltoides. С помощью анализа главных координат (PCoA в GENALEX v. 6.5) была проведена кластеризация популяций на основе матрицы парных генетических дистанций (DA) Nei [22]. Матрицы значений D были использованы также для построения UPGMA дендрограммы в пакете программ NTSYSpc 2.1 [23].

Вклад генотипов в каждую изучаемую популяцию оценивали на основе байесовского подхода с алгоритмом MCMC (цепь Маркова Монте-Карло) с помощью STRUCTURE 2.3.4 [24]. Наиболее вероятное количество кластеров определяли на основе апостериорной вероятности данных для заданного K методом Evanno в программе STRUCTURE HARVESTER [25]. Для идентификации популяционных кластеров был также использован пространственный анализ молекулярной изменчивости (SAMOVA v. 1.0) [26]. Корреляцию между генетическим и географическим расстояниями для пар выборок анализировали посредством теста Мантела [27].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате мультилокусного анализа в популяциях J. deltoides выявлен 31 аллельный вариант, из них 6 уникальных. Все локусы полиморфны с числом аллелей, варьирующим от четырех до восьми. Самые высокие показатели генетического разнообразия оказались в популяциях Краснодарского края, самые низкие – в крымских популяциях. В целом J. deltoides показал средний уровень генетического разнообразия.

Согласно тесту Харди–Вайнберга, три локуса (Jce08, Jce10, Jce11) из пяти показали значимое отклонение (P < 0.01). В локусах Jce08 и Jce11 это может быть связано с наличием нуль-аллелей. Во всех популяциях (кроме болгарской) наблюдаются отклонения от Харди–Вайнберга c дефицитом гетерозигот. Значения F высоко положительные, варьирующие от 0.137 до 0.457.

Степень генетической дифференциации между всеми анализируемыми популяциями F_ST = 14%. Согласно тесту Мантела, наблюдается высокий коэффициент корреляции по генетическим расстояниям между популяциями J. deltoides, основанный на частотах SSR-маркеров, и географическими расстояниями между ними (r = 0.869, p = 0.06). В результате пространственного анализа молекулярной изменчивости (SAMOVA) все популяции делятся на три группы по географическому расположению: Болгария, Крым и Краснодарский край. Дифференциация между этими же тремя группами была выявлена при помощи анализа главных координат на основании генетических дистанций между популяциями (рис. 2,б). Крымские популяции значительно отделены от остальных по первой главной координате (71.1% от общей изменчивости). Согласно второй главной компоненте, популяция из Болгарии дифференцируются от популяций Краснодарского края (17.28% изменчивости). На UPGMA-дендрограмме видно, что наибольшие генетические дистанции между болгарской популяцией и всеми крымско-кавказскими (рис. 2,в). Такие же три группы выявились при оценке данных STRUCTURE (K = 3, ΔK = 5.18) (рис. 2,г). Применение AMOVA для трех генетических кластеров показало статистически значимую дифференциацию (9.9% от общей изменчивости, P < 0.001).

ОБСУЖДЕНИЕ

Уровни генетического разнообразия и дифференциации у J. deltoides, обнаруженные в нашей работе, сходны с результатами, полученными для этого вида при помощи трех SSR-маркеров польскими исследователями [9]. Средняя ожидаемая гетерозиготность He в этой работе составляла 0.519, в нашей – 0.527. У J. exelsa в Турции среднее He равно 0.524 [28]. Эти показатели соответствуют среднему уровню генетического разнообразия и свидетельствуют о том, что антропогенная фрагментация в этих популяциях не оказала значительного влияния на показатели генетического разнообразия. Низкий показатель дифференциации у J. exelsa (2%) по сравнению с полученным в нашей работе у J. deltoides (9.9%) может свидетельствовать о лучшем генном потоке у первого вида или о более однородном произрастании вида на территории, на которой отбирали образцы.

При сравнении показателей генетического разнообразия у J. deltoides с таковыми у J. communis [29] оказывается, что у последнего они значительно выше (He = 0.708). Это может быть связано с тем, что J. communis, являясь холодостойким видом, имеет более широкий современный ареал и, возможно, способен был переживать ледниковые периоды в микрорефугиумах. При этом коэффициенты инбридинга у обоих видов одинаково высоки, что может определяться биологическими особенностями данных видов. Есть мнение, что это явление характерно для многих видов семейства Cupressaceae [30].

В работе с использованием SSR маркеров [9] статистически значимая дифференциация (6.7% от общей изменчивости, P < 0.001) была обнаружена между популяциями J. deltoides балканской группы (Греция, Босния и Герцеговина) и популяциями азиатской группы (Турция, Израиль и дополнительная популяция из Крыма). Выявленную структуру авторы объясняют фрагментацией ареала и/или различными рефугиумами, в которых этот вид выживал во время последнего ледникового максимума. По результатам изменчивости ITS ядерной ДНК и двух хлоропластных маркеров (petN-psbM, trnS-trnG) крымские популяции J. deltoides также оказались в одной группе с популяциями этого вида из Малой Азии (Турции) [31].

Мы обнаружили сходную дифференциацию популяций J. deltoids, согласно которой популяция J. deltoides из Болгарии может относиться к балканской группе, а крымские и кавказские популяции этого вида, по-видимому, – к азиатской группе. Кроме того, наши результаты выявили дальнейшую дифференциацию азиатской группы, показав обособленность крымских популяций от материковых кавказских.

Дифференциация крымских популяций J. deltoides не только от болгарской популяции, но и от географически близких популяций этого вида из Краснодарского края, может определяться общим своеобразием флоры этого полуострова и сложной геологической историей Черноморской впадины, а также неоднократными трансгрессиями моря – появлением и исчезновением сухопутных мостов суши. Крымская флора имеет смешанные черты, так как в прошлом испытывала влияние флоры Балкан, Кавказа и Малой Азии [12, 32]. Это нашло свое отражение и в генетической структуре некоторых видов. Например для крымского бука Fagus taurica Popl. доказано гибридное происхождение от балканского F. sylvatica s. str и кавказского F. orientalis Lipsky [33].

Для других крымских древесных видов, наоборот, миграции из разных географических источников с последующей изоляцией могли вызывать процессы генетической дифференциации. Например, по результатам анализа изменчивости хлоропластной ДНК, робуроидные дубы на полуострове делятся на две генетические группы: западную и восточную. При этом западная группа оказывается близка к группе дубов из Малой Азии, а восточная – к группе из закавказских гаплотипов [34]. Авторы делают предположения о разных путях колонизации дубов на полуострове.

Несмотря на то, что применение ITS и хлоропластных маркеров к многочисленным выборкам из восточной, западной и центральной частей Крыма не выявило дифференциации J. deltoidеs на полуострове [31], возможно это могли бы сделать микросателлитные маркеры.

Таким образом, данные, полученные в настоящей работе с использованием микросателлитных локусов, которые мы впервые применили к этому виду, подтверждают результаты других исследований, а также могут дать новую информацию, которая позволит сделать конкретные выводы о происхождении и расселении J. deltoidеs на северо-восточном краю ареала. Необходимы дальнейшие исследования с привлечением большего числа выборок из Крыма, Кавказа и Турции.

Работа выполнена в рамках государственного задания института экологии растений и животных УрО РАН № 122021000090-5.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

E. Hantemirova

Institute of Plant and Animal Ecology, Ural Division of the Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: hantemirova@ipae.uran.ru
Ресей, Ekaterinburg, 620144

Tz. Radoukova

University of Plovdiv “Paisii Hilendarski”

Email: hantemirova@ipae.uran.ru

Department of Botany and Biological Education

Болгария, Plovdiv, 4000

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар